硫化氫促進(jìn)不同缺血模型的血管新生及其機(jī)制研究.pdf

1、硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種無(wú)色、有臭雞蛋氣味的氣體。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，它被認(rèn)定為是一種有毒的氣體，大量吸入會(huì)導(dǎo)致中毒，其毒性作用主要通過(guò)抑制線粒體的細(xì)胞色素C氧化酶，影響呼吸鏈的活動(dòng)，從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的活動(dòng)。直到1989年，人們?cè)诖笫蠛腿四X中檢測(cè)到了內(nèi)源性H2S，以及接下來(lái)發(fā)現(xiàn)的催化它產(chǎn)生的三種酶，說(shuō)明H2S可能具有一定的生理作用。越來(lái)越多的研究表明，H2S在機(jī)體內(nèi)的各個(gè)系統(tǒng)中都發(fā)揮著非常重要的作用

2、。在神經(jīng)系統(tǒng)中，H2S既可以作為神經(jīng)調(diào)節(jié)因子對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能進(jìn)行調(diào)控，也可以作為神經(jīng)保護(hù)因子對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮其保護(hù)效應(yīng)。神經(jīng)元中，它可以增強(qiáng)NMDA受體活性，易化長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)作電位的產(chǎn)生，對(duì)記憶過(guò)程產(chǎn)生影響。在心血管系統(tǒng)中，H2S通過(guò)開(kāi)放血管平滑肌細(xì)胞上ATP敏感的鉀通道（KATP通道），引起血管平滑肌細(xì)胞舒張，降低血壓。在缺血再灌注模型中，它可以減小心梗面積，改善心梗后左心室功能。消化系統(tǒng)中，H2S可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取

3、，增加葡萄糖耐量和胰島素敏感性。鑒于H2S對(duì)身體各個(gè)系統(tǒng)的重要的調(diào)節(jié)作用，還有它是一種小分子量的氣體分子，能穿透細(xì)胞膜直接起效，在體內(nèi)產(chǎn)生并受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，生理濃度時(shí)有明確的功能并能被外源性氣體模擬，H2S成為繼一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后的第三個(gè)氣體信號(hào)分子。
　　血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上通過(guò)血管外基質(zhì)降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移形成子代血管支并具有

4、血運(yùn)功能的一個(gè)過(guò)程。它可發(fā)生于組織生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤生長(zhǎng)等多種生理、病理過(guò)程中。在血管新生方面，我課題組于2007年在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)外源性H2S具有顯著的促血管新生作用。它不僅可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移和管腔形成，還可以在小鼠Matrigel Plug動(dòng)物模型上促進(jìn)血管的新生。隨后Szabo C等在雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型中也證實(shí)了H2S的促血管新生效應(yīng)。
　　缺血性疾病是一種臨床上常見(jiàn)的高致殘率、高致死率的疾病，它是

5、由病理或者外界損傷導(dǎo)致機(jī)體動(dòng)脈或者靜脈血流急劇降低或中斷，使得該血管的血供區(qū)失去氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給造成的。傳統(tǒng)的缺血性疾病的治療方法側(cè)重于血管的再通，而忽略了血管再灌時(shí)對(duì)微循環(huán)的傷害，于是誕生了治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)。它是指將外源性血管新生誘導(dǎo)因子（如VEGF、bFGF）或其基因片段或干細(xì)胞轉(zhuǎn)入缺血組織中，增強(qiáng)缺血區(qū)的側(cè)支毛細(xì)血管新生，改善缺血區(qū)的血流，促進(jìn)缺血區(qū)血供恢復(fù)。正常生理狀態(tài)下，H

6、2S可以明顯地促進(jìn)血管新生，在疾病狀態(tài)，如組織缺血時(shí)，H2S是否也能促進(jìn)血管新生，以及促進(jìn)缺血組織血管新生的機(jī)制是什么，具有重要的研究?jī)r(jià)值。因此在本文中，我們將重點(diǎn)探討H2S在不同缺血模型中的促血管新生作用及其作用機(jī)制，為治療性血管新生提供新的策略。
　　首先，我們觀察了外源性NaHS腹腔注射連續(xù)4W對(duì)大鼠缺血下肢血管新生的影響。熒光微球法測(cè)血流結(jié)果顯示，NaHS20和50μmol/kg/day腹腔注射連續(xù)4W，能夠顯著改善缺血下

7、肢的血流供應(yīng);血管造影發(fā)現(xiàn)，NaHS50和100μmol/kg/day慢性給藥組的側(cè)枝血管形成最多;免疫組化結(jié)果表明各濃度的NaHS處理組能夠不同程度地促進(jìn)缺血下肢微血管的生成，以NaHS50μmol/kg/day處理組效果最為顯著;50μmol/kg/day的NaHS慢性給藥組還能夠顯著提高增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)在兩種細(xì)胞上的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的增殖

8、;在缺血下肢中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）主要表達(dá)在骨骼肌細(xì)胞上，且不同劑量的NaHS腹腔注射連續(xù)4W，能夠不同程度地提高VEGF的表達(dá);而VEGF受體2型(vascular endothelial growth factor receptor2,VEGFR2)和phospho-VEGFR2主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上，NaHS不改變VEGFR2的表達(dá)量，但是能夠顯著增強(qiáng)VE

9、GFR2的磷酸化;而且NaHS也能夠提高缺血組織中Akt的磷酸化水平。以上結(jié)果說(shuō)明，NaHS確實(shí)能夠促進(jìn)大鼠缺血下肢的血管新生，改善缺血區(qū)的血供，該作用可能和促進(jìn)缺血區(qū)骨骼肌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)以及內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR2的磷酸化有關(guān)。
　　其次，我們成功建立了小鼠的心梗模型。并利用心電圖(electrocardiogram，ECG)、心超、Evans'Blue-TTC染色和蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosinst

10、aining，HE染色）等技術(shù)，驗(yàn)證心梗模型是否成功。心梗手術(shù)后，小鼠心臟前壁變白，心跳減緩;ECG顯示，ST段（J點(diǎn)）抬高，呈現(xiàn)缺血性變化;心超結(jié)果顯示，與sham組相比，手術(shù)組EF和FS值明顯降低;心肌酶譜檢測(cè)結(jié)果顯示，血漿中LDH、CK和CK-MB含量升高;Evans'Blue-TTC染色可以明顯地看到變白的梗死區(qū)域;HE染色可以看到心梗后2W，梗死區(qū)被大量纖維組織代替。以上檢測(cè)手段都說(shuō)明，小鼠心梗模型建立成功。
　　再次，

11、我們?cè)诔晒⒌男∈笮墓ＤＰ偷幕A(chǔ)上，觀察了H2S對(duì)小鼠心梗后血管新生情況和心肌保護(hù)作用。免疫組化結(jié)果表明，NaHS50μmol/kg/day腹腔注射2W能夠促進(jìn)心臟危險(xiǎn)區(qū)微血管的形成，緩解缺血導(dǎo)致的心功能損傷;而且不同劑量的NaHS腹腔注射4W都能降低小鼠的死亡率，尤其以NaHS50μmol/kg/day給藥組小鼠的死亡率最低;ELISA的結(jié)果顯示，外源性H2S處理并不改變?nèi)毖募〗M織中VEGF的含量;卻顯著增加CSE、CBS和3-M

12、ST的蛋白表達(dá)，并且升高血漿中H2S的含量。、
　　接下來(lái)，我們利用CSE基因敲除的小鼠，初步觀察了內(nèi)源性H2S在促血管新生中的作用。結(jié)果顯示，CSE基因敲除小鼠心梗后，微血管形成數(shù)量更少;此時(shí)，雖然CBS和3-MST蛋白表達(dá)明顯升高，但是血漿中H2S含量更低;同時(shí)，心梗后組織中VEGF的含量明顯降低。以上結(jié)果說(shuō)明了內(nèi)源性H2S在心梗后血管新生中也起到一定的作用。最后，我們利用培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞，觀察了H2S對(duì)缺氧下心肌細(xì)胞的保護(hù)

13、作用。LDH和CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧6h后，心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞活力降低;NaHS處理能夠明顯改善這種狀況;western blot和ELISA的結(jié)果顯示，缺氧后心肌細(xì)胞VEGF表達(dá)和分泌都升高，但是NaHS并不影響VEGF的表達(dá)和分泌;缺氧后心肌細(xì)胞內(nèi)CSE和3-MST蛋白表達(dá)不變，CBS蛋白表達(dá)明顯升高;NaHS處理升高CBS的表達(dá)，但是不影響CSE和3-MST的表達(dá)。同時(shí)，HPLC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧時(shí)心肌細(xì)胞培液中H2

14、S含量降低，NaHS處理后能夠升高培液中H2S的含量。利用CSE SiRNA敲低CSE的表達(dá)后，CSE蛋白表達(dá)降低，同時(shí)培液中H2S含量明顯降低;LDH和CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重，說(shuō)明內(nèi)源性的H2S在保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞中的作用。
　　綜上所述，本文通過(guò)以上一些列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2S可以促進(jìn)大鼠缺血下肢的血管新生，該作用可能和VEGF介導(dǎo)的旁分泌作用有關(guān);H2S可以促進(jìn)小鼠心梗后的血管新生，緩解缺血對(duì)心臟的損傷，該作用可能和三