RPN4的生理功能及其降解研究.pdf

1、泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)一直是胞內(nèi)用來(lái)清除異常的蛋白質(zhì)和選擇性降解各種生化過(guò)程中調(diào)控蛋白的執(zhí)行者，它可以降解錯(cuò)誤折疊的蛋白也可以及時(shí)更新細(xì)胞周期過(guò)程中的調(diào)控因子，對(duì)細(xì)胞的各種生化過(guò)程進(jìn)行精密的調(diào)節(jié)，從而可以將胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量維持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平，保證正常生命活動(dòng)的規(guī)律性[1-3]。 芽殖酵母的RPN4(RegulatingParticleNoneATPase-4)基因，亦稱SON1和UFD5，最開始是作為溫度敏感株的抑制子S

2、uppressor被發(fā)現(xiàn)的，即PRN4的失活突變可以恢復(fù)sec63-101在限制溫度下的生長(zhǎng)缺陷。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，RPN4基因的突變還可以穩(wěn)定泛素融合底物(UFDpathway的底物)UB-Vβgal，在不影響其多聚泛素化的情況下，阻礙26S蛋白酶體對(duì)它的降解，因此亦被命名為UFD5。 以前的研究表明在蛋白酶體的32個(gè)亞基中有26個(gè)基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域含有PACE(Proteasome-associatedcontrolelemen

3、t)序列，而RPN4正是這段順式轉(zhuǎn)錄元件的反式轉(zhuǎn)錄因子，并且其自身的降解也必須靠蛋白酶體來(lái)實(shí)現(xiàn)。這暗示了一種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制的存在：RPN4上調(diào)蛋白酶體亞基的水平，上調(diào)的亞基組裝成有活性的蛋白酶體又反過(guò)來(lái)降解自身的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而將其下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——蛋白酶體亞基維持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平，保證細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。 本論文的結(jié)果提供了直接的證據(jù)證明負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制的存在，首先在兩種不同的蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)觀察到RPN4蛋白的半

4、衰期大大延長(zhǎng)，穩(wěn)定性明顯升高，隨后檢測(cè)受其調(diào)控的下游蛋白酶體亞基的水平，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，在蛋白酶體活性受損的突變型酵母菌株內(nèi)其各個(gè)亞基的豐度都有大幅度提高，Northern檢測(cè)證實(shí)這種升高是由轉(zhuǎn)錄水平的增強(qiáng)引起的并且隨著RPN4穩(wěn)定性的增加而增加。這些結(jié)果都表明在蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)由于對(duì)RPN4的降解能力減弱，增加了RPN4在細(xì)胞內(nèi)的豐度，上調(diào)了其各個(gè)亞基的轉(zhuǎn)錄水平，從而在數(shù)量上對(duì)胞內(nèi)受損的蛋白酶體給與補(bǔ)充，使其達(dá)到新的動(dòng)態(tài)平衡

5、，維持細(xì)胞正常的蛋白酶體活力水平。之后我們做了大量的酵母菌株表型測(cè)試試驗(yàn)，結(jié)果與預(yù)想的一致，在蛋白酶體單亞基突變?cè)斐傻幕钚允軗p菌株中酵母的存活率與生長(zhǎng)速度都與野生型相差無(wú)幾，但是當(dāng)在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)損傷蛋白酶體的活性并去除RPN4介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制之后，菌株就表現(xiàn)出強(qiáng)烈的合成致死效果，存活率大大降低，生長(zhǎng)速度也十分緩慢，可見在RPN4缺失的情況下，受損的蛋白酶體無(wú)法在數(shù)量上得到補(bǔ)給，給菌株的生長(zhǎng)帶來(lái)了毀滅性的災(zāi)害。此外，為了研究蛋白酶體各個(gè)

6、亞基對(duì)上游轉(zhuǎn)錄因子RPN4的應(yīng)答，我們選用位于20S核心顆粒的不同亞基做標(biāo)記，正是這個(gè)偶然的機(jī)會(huì)使我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用目前普遍使用的純化26S蛋白酶體的方法來(lái)做體外活性實(shí)驗(yàn)時(shí)，其蛋白酶體的活性在純化過(guò)程中就已經(jīng)受到了損傷，從表型上看，在RPN4缺失的情況下，26S蛋白酶體的表達(dá)量雖然不如野生型，但是仍然可以足夠維持酵母細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，如果同時(shí)在蛋白酶體亞基PRE2的末端加上TAG，就嚴(yán)重影響了菌株的存活率和生長(zhǎng)速度，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的合成致死。說(shuō)

7、明由末端加上TAG的PRE2組裝的26S蛋白酶體的活性已經(jīng)大大不如野生型，這些結(jié)果都為將來(lái)的蛋白酶體體外活性實(shí)驗(yàn)提供了很好的指導(dǎo)。由于最新的報(bào)道表明，26S蛋白酶體以及一些RPN4的下游基因都參與了DNA的修復(fù)過(guò)程，這種相關(guān)性使我們想進(jìn)一步探求在DNA損傷試劑的作用下，RPN4-蛋白酶體負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制是否在整個(gè)DNA復(fù)制后修復(fù)過(guò)程中起了關(guān)鍵的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在MMS作用之后，蛋白酶體的活性有所損傷，但是其在細(xì)胞內(nèi)的豐度明顯增加，并且

8、這種增加表現(xiàn)出強(qiáng)烈的RPN4依賴性。有可能在DNA損傷試劑作用之后，很多壓力敏感的蛋白由于表現(xiàn)異常，無(wú)法形成正確的構(gòu)象執(zhí)行功能，需要被26S蛋白酶體降解。而RPN4正是介導(dǎo)了在此應(yīng)激狀態(tài)下蛋白酶體總量最大程度的提高。 鑒于酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體的總量始終受以RPN4為核心的負(fù)反饋機(jī)制的調(diào)控，所以對(duì)轉(zhuǎn)錄因子RPN4降解途徑的研究就顯得尤為重要。之前的工作表明，RPN4存在兩條相互獨(dú)立且蛋白酶體依賴的降解途徑，一條是與底物的多聚泛素化

9、有關(guān)的泛素依賴性降解，而另一條則是與N端的前10個(gè)氨基酸有關(guān)的泛素非依賴性降解。為了將底物的這兩條降解途徑分開，我們?cè)谝呀?jīng)報(bào)道的15種E3缺失突變的酵母菌株中表達(dá)了去除其泛素非依賴性降解信號(hào)的底物——N端缺失的RPN4，結(jié)果顯示只有在ubr2△的酵母菌株中才能夠檢測(cè)到底物的存在，相應(yīng)的Pulse-chase試驗(yàn)結(jié)果也表明，UBR2的缺失致使細(xì)胞中的底物蛋白完全穩(wěn)定了。之后，當(dāng)我們用全長(zhǎng)的RPN4做同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí)也得到了類似的結(jié)果，雖然全長(zhǎng)

10、蛋白的泛素非依賴性降解途徑仍在繼續(xù)，但是由于其泛素依賴性降解途徑的阻斷，蛋白底物的半衰期大大延長(zhǎng)，穩(wěn)定性有明顯的提高。據(jù)此推測(cè)UBR2極有可能參與了RPN4的多聚泛素化降解過(guò)程。根據(jù)以前酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，UBR2可以與N-endrule信號(hào)通路的E2-RAD6相互結(jié)合，因此我們推測(cè)RAD6極有可能在RPN4的泛素依賴性降解途徑中也行使E2的功能。從理論上講，含有RING結(jié)構(gòu)域的E3可以作為媒介將E2與底物蛋白在空間上聚攏在一起，以最

11、優(yōu)化的方式使底物直接從E2獲得Ubiquitin。為了證實(shí)以上對(duì)RAD6蛋白功能的推測(cè)，我們做了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明RAD6和底物RPN4都可以與UBR2發(fā)生特異性結(jié)合，而且在RAD6△的菌株內(nèi)，N端缺失的RPN4蛋白泛素依賴性降解途徑也被完全阻斷了。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都從不同的側(cè)面向我們描繪出細(xì)胞內(nèi)RPN4多聚泛素化反應(yīng)的基本過(guò)程，為了證實(shí)以上所有對(duì)RPN4降解途徑的推測(cè)，我們?cè)隗w外重建了整個(gè)泛素化反應(yīng)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)只有在E1，RAD6，U

12、BR2，RPN4都存在的情況下，才可以看到多聚泛素鏈形成。說(shuō)明底物RPN4的多聚泛素化反應(yīng)確實(shí)需要特異的E3-UBR2的參與。 由于蛋白酶體的豐度和活性大小與酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)，而RPN4又是蛋白酶體亞基轉(zhuǎn)錄所必需的反式轉(zhuǎn)錄因子，所以酵母細(xì)胞內(nèi)UBR2的缺失必然會(huì)導(dǎo)致RPN4的降解受到抑制，在細(xì)胞內(nèi)的豐度增加，從而進(jìn)一步促進(jìn)下游26S蛋白酶體的轉(zhuǎn)錄，提高其在細(xì)胞內(nèi)的整體水平。為了研究RPN4的累積對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，

13、我們做了菌株的表型測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否在野生型還是在UBR2缺失型的酵母中過(guò)量表達(dá)RPN4，菌株的生長(zhǎng)速度和存活率都沒有明顯的差異。推測(cè)可能是因?yàn)榉核胤且蕾囆越到馔緩降拇嬖?，使得由UBR2缺失而穩(wěn)定的RPN4又很快在細(xì)胞內(nèi)被26S蛋白酶體降解，所以無(wú)法發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用；又或者酵母細(xì)胞本身就可以在正常的生長(zhǎng)條件下忍受高于普通水平的RPN4和蛋白酶體。之后，為了進(jìn)一步確證在蛋白酶體活性受損的情況下，累積的RPN4是否會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)

14、生影響。我們?cè)诘鞍酌阁w活性受損以及同時(shí)伴有UBR2缺失的酵母菌株內(nèi)過(guò)量表達(dá)RPN4，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)速度和存活率都明顯低于同源的野生型菌株，并且這種表型的缺陷呈現(xiàn)出很強(qiáng)的RPN4劑量依賴性。相比之下，在同樣背景的酵母菌株內(nèi)過(guò)量表達(dá)喪失了轉(zhuǎn)錄活性的RPN4(C477A)，由UBR2缺失而穩(wěn)定的RPN4卻沒有對(duì)菌株的表型產(chǎn)生任何影響。所有這些結(jié)果都證明在蛋白酶體活性受損的菌株內(nèi)UBR2缺失引起的RPN4蛋白的累積對(duì)菌株生長(zhǎng)的毒性，有可能是由其下游