神經(jīng)元活性調(diào)控TrkB受體細(xì)胞膜表面插入機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 神經(jīng)元突觸可塑性對神經(jīng)環(huán)路的建立和控制腦的認(rèn)知功能及復(fù)雜行為具有重要作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活、分化、樹突和軸突的生長，尤其在調(diào)節(jié)突觸的可塑性中起關(guān)鍵作用。BDNF參與包括從神經(jīng)肌肉接頭到中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的突觸發(fā)育和功能執(zhí)行；尤其重要的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)；BDNF對于維持突觸間的LTP是必需的。此外，它還參與了早老性癡呆、抑郁

2、癥和藥物成癮等神經(jīng)精神疾病的病理生理過程，有望成為治療這些疾病的一種手段。
　　 然而BDNF作為一種易于擴(kuò)散的分子，它如何能做到優(yōu)先作用于高活性的神經(jīng)元或神經(jīng)突觸的?一種可能性是BDNF可以在高活性突觸部位局部合成和分泌；另一種是高活性神經(jīng)元及其突觸對于BDNF比非活性狀態(tài)的神經(jīng)元有更好的反應(yīng)性，后者成為是我們研究的聚焦點(diǎn)。
　　 受體胞內(nèi)運(yùn)輸與其胞內(nèi)域和相關(guān)分子的結(jié)合及調(diào)控有關(guān)，因此我們通過酵母雙雜交及及蛋白質(zhì)免疫沉

3、淀的方法，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)TrkB受體的胞內(nèi)域能和carboxypeptidase E(CPE)結(jié)合。CPE是羧肽酶的一種，在高爾基體TGN中CPE具有分選受體的作用，可分選目的蛋白：如BDNF、POMC等分泌性蛋白進(jìn)入可調(diào)性分泌途徑，這一過程受胞內(nèi)蛋白激酶的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)表明缺失C末端4個(gè)或15個(gè)氨基酸參基的CPE不能參與到RSP中、CPE的敲基因小鼠有肥胖、神經(jīng)突觸傳遞障礙等表型，這些表型與TrkB基因敲除小鼠的表型有相似性。我們推測CPE介

4、導(dǎo)神經(jīng)元活性促進(jìn)TrkB受體插入到細(xì)胞膜表面的過程。
　　 總之神經(jīng)元活性能促進(jìn)TrkB受體在胞膜表面的分布，但其復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究旨在深入認(rèn)識神經(jīng)元活性對TrkB受體胞內(nèi)運(yùn)輸調(diào)控的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制及其相應(yīng)的生物學(xué)意義，這不僅有助于我們深入認(rèn)識BDNF作用的機(jī)制，也能為今后臨床應(yīng)用BDNF治療神經(jīng)精神疾病提供指導(dǎo)。
　　 方法與結(jié)果：
　　 1、TrkB受體細(xì)胞膜表面表達(dá)水平免疫熒光定量分析方法的建

5、立
　　 本課題首先通過構(gòu)建FLAG-TrkB-GFP表達(dá)質(zhì)粒建立了”TrkB受體細(xì)胞膜表面分布比例的熒光定量分析方法”，該方法能夠直接從形態(tài)學(xué)角度進(jìn)行不同時(shí)空條件下TrkB受體膜表面分布水平的檢測，且通過膜表面生物素化法確定了其有效性，從而為獲得TrkB受體活性依賴性膜表面插入機(jī)制的依據(jù)奠定了一定的基礎(chǔ)。通過該方法結(jié)合膜表面生物素化的方法我們發(fā)現(xiàn)LTP的化學(xué)性誘導(dǎo)劑-glycin能有效地提高TrkB受體在神經(jīng)元膜表面的含量(1

6、.82±0.08倍)，從而將glycine作為后續(xù)研究TrkB受體活性依賴性膜表面插入機(jī)制的神經(jīng)元活性誘導(dǎo)劑—被稱為cLTP。
　　 2、神經(jīng)元細(xì)胞膜表面TrkB受體分布比例的測定
　　 為了更加準(zhǔn)確地了解不所構(gòu)建的神經(jīng)元表達(dá)系統(tǒng)中紅綠兩種熒光強(qiáng)度的比值，利用此參數(shù)換算得到在基礎(chǔ)狀態(tài)下神經(jīng)元膜表面TrkB受體占總體TrkB的比例為34％同條件下TrkB受體在細(xì)胞膜上變化的量化指標(biāo)，我們通過免疫熒光定量分析方法分別測定，證

7、明TrkB在神經(jīng)元非活性狀態(tài)下大都存在于胞質(zhì)內(nèi)的TrkB受體存儲池中，只有在神經(jīng)元被激活后才會快速聚集并插入到膜表面。通過此定量方法我們發(fā)現(xiàn)TrkB受體活性依賴性膜表面插入過程在神經(jīng)元突起明顯多于胞體(1.98倍vs.1.35倍)，可以用于解釋BDNF突觸可塑性等功能的發(fā)揮。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用突起中的熒光強(qiáng)度值定量分析TrkB的膜表面分布水平。
　　 3、TrkB的近膜區(qū)是其活性依賴性膜表面插入的充分必要條件
　　 更有

8、意義的是，我們通過構(gòu)建TrkB的缺失突變體pEGFP-FLAGTrkB△JM，pEGFP-FLAGTrkB△TK，pEGFP-FLAGTrkB△CT即缺失相應(yīng)胞內(nèi)區(qū)域：近膜區(qū)、激酶區(qū)和C末端區(qū)的突變體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入海馬神經(jīng)元，結(jié)合前述免疫熒光定量分析方法發(fā)現(xiàn)只有表達(dá)pEGFP-FLAGTrkB△JM的海馬神經(jīng)元喪失了活性依賴性TrkB受體胞膜表面插入現(xiàn)象，說明近膜區(qū)是TrkB受體活性依賴性向膜表面插入的必要條件；用同樣的方法我們又證實(shí)神經(jīng)

9、細(xì)胞中天然存在的TrkB的截短突變體T1刊不具有活性依賴性的膜表面插入行為；在T1受體胞內(nèi)區(qū)末端分別嫁接近膜區(qū)、激酶區(qū)和C末端區(qū)構(gòu)建pEGFP-FLAGT1JM，pEGFP-FLAGT1TK，pEGFP-FLAGT1CT質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染神經(jīng)元后發(fā)現(xiàn)：只有嫁接了JM區(qū)的T1在cLTP發(fā)生后出現(xiàn)了膜表面TrkB的明顯增加，這一結(jié)果說明近膜區(qū)是TrkB受體活性依賴性膜表面聚集的充分條件。因此，TrkB的JM區(qū)既是其活性依賴性膜表面插入過程的充分條件

10、又是必要條件，在此過程中發(fā)揮了重要的結(jié)構(gòu)性作用。
　　 4、Cdk5激酶活性影響TrkB的活性依賴性膜表面插入
　　 為了進(jìn)一步探討何種激酶參與了TrkB受體的調(diào)節(jié)并促進(jìn)其活性依賴性向膜表面運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制，我們采用Cdk5激酶的抑制劑和Cdk5的RNA干擾質(zhì)粒這兩種降低Cdk5作用的方法，同時(shí)結(jié)合以上免疫熒光分析方法發(fā)現(xiàn)Cdk5的激酶活性參與了TrkB的活性依賴性膜表面插入；有報(bào)道Cdk5磷酸化TrkB在BDNF促進(jìn)神經(jīng)元樹

11、突生長中發(fā)揮重要作用，將此關(guān)鍵位點(diǎn)：JM區(qū)478位的Ser突變?yōu)锳la構(gòu)建點(diǎn)突變體FLAG-TrkBS478A-GFP，或?qū)1的胞內(nèi)域嫁接JMS478A構(gòu)建T1JMS478A，結(jié)果是它們均喪失了cLTP活性促進(jìn)膜表面受體插入的現(xiàn)象；同時(shí)Cdk5在cLTP刺激下，其15位Tyrr和159位Ser有顯著的磷酸化現(xiàn)象。以上均提示Cdk5激酶磷酸化TrkB478位點(diǎn)的酪氨酸對于TrkB活性依賴性膜表面插入過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。另一方面，利用

12、免疫熒光分析方法結(jié)合Trk激酶的抑制劑及TrkB酪氨酸激酶活性缺失突變體FLAG-TrkBKD-GFP我們發(fā)現(xiàn)TrkB活性依賴性膜表面聚集并不依賴于Trk激酶的活性。
　　 5、cLTP促進(jìn)TrkB受體明顯趨向于聚集到突觸后膜
　　 為了明確cLTP導(dǎo)致的TrkB膜表面插入是否有空間分布的差別，通過突觸后標(biāo)志蛋白PSD95標(biāo)記突觸后膜區(qū)，結(jié)合免疫熒光檢測共定位的方法發(fā)現(xiàn)：比較非突觸后區(qū)域，在cLTP刺激后TrkB以大約2

13、倍的差別更多地聚集于突觸后區(qū)域，而對于近膜區(qū)缺失突變體TrkB△JM并無差異。進(jìn)而TrkB膜表面含量的免疫熒光定量檢測實(shí)驗(yàn)證明TrkB以2.13比1.75倍的差別顯著地聚集在突觸后膜上，同時(shí)提示JM區(qū)對于此過程也是必需的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 6、羧肽酶E的C末端能夠與TrkB受體胞內(nèi)區(qū)結(jié)合
　　 在通過酵母雙雜交方法首次發(fā)現(xiàn)CPE能夠與TrkB受體結(jié)合后，構(gòu)建MYC-CPE的質(zhì)粒后我們又通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀的方法證明了不論外

14、源轉(zhuǎn)染過表達(dá)的蛋白還是內(nèi)源性表達(dá)蛋白，這兩種蛋白間都能夠結(jié)合。除此之外，通過激光共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了二者在神經(jīng)元中具有共定位的特性，即二者存在于共同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。因TrkB胞內(nèi)區(qū)是調(diào)控其胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵區(qū)域，分別構(gòu)建CPE與TrkB的缺失突變體以得到只保留胞內(nèi)區(qū)的FLAG-TrkB IC和只保留胞質(zhì)側(cè)25個(gè)氨基酸的MYC-CPE25AA-RFP，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀(CO-IP)的方法發(fā)現(xiàn)CPE胞內(nèi)區(qū)的25個(gè)氨基酸可以與TrkB

15、受體胞內(nèi)區(qū)結(jié)合。
　　 7、羧肽酶E參與TrkB受體活性依賴性細(xì)胞膜表面插入過程的調(diào)節(jié)
　　 通過設(shè)計(jì)和構(gòu)建CPE的小干擾RNA質(zhì)粒(siRNA)并通過免疫熒光和Western blot分別檢測其干擾效率。通過共轉(zhuǎn)染CPE siRNA與FLAG-TrkB-GFP質(zhì)粒，結(jié)合TrkB膜表面含量的免疫熒光定量分析方法我們發(fā)現(xiàn)：CPE的表達(dá)被干擾后，cLTP激活的細(xì)胞膜表面TrkB受體聚集明顯被抑制。這一結(jié)果使我們進(jìn)一步推測CP

16、E很可能參與了TrkB受體的活性依賴性膜表面插入的過程。本課題后續(xù)的實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行中。
　　 結(jié)論：
　　 1、所建立的細(xì)胞膜表面TrkB受體定量檢測的免疫熒光分析方法，可以從空間即細(xì)胞的不同區(qū)域和時(shí)間上定量分析不同條件下TrkB膜表面的變化情況，為后續(xù)研究TrkB活性依賴性膜表面插入的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2、定量分析了在非活化的基礎(chǔ)狀態(tài)下海馬神經(jīng)元膜表面TrkB受體占胞內(nèi)總體TrkB的比例為34％，說明TrkB的在被激活后是

17、從胞內(nèi)存儲池中插入到膜表面的，同時(shí)此定量分析更能準(zhǔn)確掌握細(xì)胞在不同條件下膜表面TrkB受體的變化情況。
　　 3、明確了TrkB近膜區(qū)(JM)是其活性依賴性膜表面插入過程的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域，是此過程的必要和充分條件，并且對于TrkB快速聚集到突觸后膜并插入細(xì)胞膜也是關(guān)鍵性調(diào)控區(qū)域。
　　 4、發(fā)現(xiàn)Cdk5激酶活性對于cLTP誘導(dǎo)的TrkB膜表面聚集的增加是重要影響因素，Cdk5對于TrkB JM區(qū)478位點(diǎn)Tyr的磷酸化參與