Orexin和組胺對(duì)舌下神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用及其內(nèi)在機(jī)制.pdf

1、目的:探明CIH對(duì)orexin的影響及其orexin和組胺對(duì)HMs的調(diào)控作用，不僅有利于完善OSAHS的中樞調(diào)控機(jī)制，而且有利于尋找OSAHS治療的新靶點(diǎn)，為未來(lái)OSAHS的藥物治療提供基礎(chǔ)。因此，本研究旨在通過(guò)間歇低氧艙和膜片鉗技術(shù)，深入研究:(1)CIH對(duì)大腦orexin系統(tǒng)的影響，從而探明orexin在OSAHS患者夜間覺醒中所扮演的作用;(2) Orexin對(duì)HMs興奮性的調(diào)控作用和具體機(jī)制，從而探明orexin反向?qū)SAHS

2、的調(diào)節(jié)作用;(3)探明組胺對(duì)HMs興奮性的調(diào)控作用和具體機(jī)制，完善OSAHS的中樞調(diào)控機(jī)制。首先，本研究第一部分采用間歇低氧和膜片鉗電流鉗的方法，研究orexin和OSAHS相互影響。本研究的第二部分將結(jié)合電壓鉗和電流鉗的方法，深入研究組胺對(duì)HMs的調(diào)控作用，及其受體機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程和離子機(jī)制。
　　方法:1.采用自制的CIH動(dòng)物艙，通過(guò)控制艙內(nèi)氧氣和氮?dú)獾牧髁浚沟妹恳淮稳毖跹h(huán)時(shí)間為1min，氧氣濃度循環(huán)于6％-21％之間，

3、將40只大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為IH1周組、IH5周組、復(fù)氧組和兩個(gè)對(duì)照組，將IH組置于動(dòng)物艙給予間歇低氧，每天8小時(shí)，每周7天。復(fù)氧組前35天處理同CIH組，第36天起艙內(nèi)輸入空氣，每天8小時(shí)，持續(xù)5周。兩個(gè)對(duì)照組均輸入空氣，其余條件與IH組相同，分別持續(xù)1周和5周(IA1周和IA5周組)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)監(jiān)測(cè)大腦下丘腦PPO、下丘腦和延髓OX1R和OX2R mRNA的表達(dá)水平。

4、2.采用國(guó)際通氣的膜片鉗技術(shù)，將出生約6-10天的大鼠幼崽HMN切成含成活HMs的急性腦片，通過(guò)電流鉗記錄和分析系統(tǒng)研究orexin A對(duì)HMs發(fā)放速率和膜電位的影響，及其OX1R和OX2R受體拮抗劑對(duì)orexin A效應(yīng)的影響。3.采用膜片鉗技術(shù)中的電流鉗和電壓鉗技術(shù)，將出生約10-16天的大鼠幼崽的HMN切成含成活HMs的急性腦片，記錄和分析組胺對(duì)HMs的調(diào)控作用，及其受體機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程和離子機(jī)制。
　　結(jié)果:1.CIH上

5、調(diào)下丘腦PPO的表達(dá)水平，復(fù)氧能有效逆轉(zhuǎn)這種上調(diào),RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，間歇低氧1周能顯著降低下丘腦PPOmRNA的表達(dá)水平(相對(duì)分光度為0.49±0.11 vs.1.00±0.15，P＜0.05)。與1周不同，間歇低氧5周后下丘腦PPO mRNA的水平達(dá)到對(duì)照組的2.1倍(P＜0.05)。8只經(jīng)過(guò)5周CIH的大鼠再經(jīng)5周復(fù)氧后，PPO mRNA的表達(dá)水平與5周對(duì)照組沒(méi)有明顯的差異(相對(duì)分光度為1.32±0.09 vs.1

6、.00±0.12，P＞0.05)。然而，復(fù)氧組與CIH組相比差異明顯(P＜0.05)。2.CIH增加下丘腦和延髓orexin受體的表達(dá).下丘腦是覺醒控制的重要區(qū)域，而延髓是HMN的所在地，與OSAHS密切相關(guān)。RT-PCR結(jié)果顯示，1周的IH不能改變下丘腦和延髓OX1R mRNA的表達(dá)，但是與1周對(duì)照組相比，其明顯增加延髓OX2R的表達(dá)。當(dāng)IH時(shí)間增長(zhǎng)到5周時(shí)，下丘腦和延髓中的OX1R和OX2R都出現(xiàn)明顯的上升。其中，OX2R在延髓的平

7、均表達(dá)水平達(dá)到對(duì)照的4.5倍，OX1R在延髓的平均表達(dá)水平也達(dá)到2.41倍。5周的復(fù)氧后，下丘腦OX1R和OX2R mRNA水平上升明顯得到逆轉(zhuǎn)，與IA5周組無(wú)明顯差異。復(fù)氧后延髓OX2R的表達(dá)水平依然高于對(duì)照的IA5周組(P＜0.05），但也明顯低于CIH組(P＜0.05）。3.Orexin A增加HMs的發(fā)放速率并使其膜去極化全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示，胞外灌流液中加入orexin A(4-500 nM)，能顯著的增加HMs的發(fā)放速率并使

8、HMs膜去極化。這種興奮效應(yīng)具有劑量依賴性，4 nM、20 nM、100 nM和500 nM的orexin A分別使HMs的發(fā)放速率增加108.75％±0.42％(P＞0.05，與control對(duì)比，n=7)、148.45±6.01％(P＜0.05，n=13)，203.95±9.18(P＜0.05,n=16)和310.91±18.19％(P＜0.05,n=9);4nM、20nM、100nM和500nM的orexin A分別使HMs的膜電

9、位去極化1.00±0.13mV(n=7)、3.98±0.46mV(n=13)、7.27±0.72mV(n=16)和16.72±1.49mV(n=9)。4.OX1R和OX2R共同介導(dǎo)orexin A對(duì)HMs的興奮作用。胞外灌流液中預(yù)先加入TTX（1μM）并不能拮抗orexin A的去極化作用，說(shuō)明orexin A的作用是直接的突觸后膜效應(yīng)。胞外液預(yù)先加入orexin1受體拮抗劑SB334867(10μM)，orexin A(100nM)引

10、起的發(fā)放增加明顯減弱（174.08±4.72％vs.203.95±9.18％，P＜0.05，n=7）。同樣，預(yù)先加入orexin2受體拮抗劑TCS OX229(10μM)后，orexinA(100nM)引起的發(fā)放增加作用也明顯減弱(136.43±3.83 vs.203.95±9.18％，P＜0.05，n=7)。不僅如此，兩個(gè)拮抗劑均能分別拮抗orexin A的去極化作用。當(dāng)SB334867和TCS OX229合用時(shí)，oreixn A不僅

11、不能增加HMs的發(fā)放速率，而且不能引起膜去極化。說(shuō)明OX1R和OX2R共同介導(dǎo)了orexinA的作用。5.組胺引起內(nèi)向電流從而使HMs膜去極化，并且有脫敏作用電流鉗記錄顯示，胞外灌流液中加入組胺(3-100μM)能引起HMs的膜去極化。這種去極化效應(yīng)具有劑量依賴性，3μM、10μM、30μM和100μM的組胺分別使HMs去極化1.13±0.09mV(n=9)、2.96±0.24mV(n=10)、7.26±0.33mV(n=13)和12.

12、29±1.10mV(n=9)。但如果給同一個(gè)細(xì)胞或同一塊腦片灌流兩次組胺后發(fā)現(xiàn)，第二次給藥引起的去極化較第一次減少(3.17±0.43mV vs.7.60±0.35mV, P＜0.05，n=9)，說(shuō)明組胺的效應(yīng)具有脫敏。電壓鉗顯示，組胺使HMs去極化的原因是產(chǎn)生了一個(gè)內(nèi)向電流。6.H1R介導(dǎo)了組胺對(duì)HMs的興奮作用。TTX不能拮抗組胺的去極化作用，TTX、bicuculline、APV和CNQX共同作用不能拮抗組胺產(chǎn)生的內(nèi)向電流，說(shuō)明組

13、胺的效應(yīng)是一種直接的突觸后膜效應(yīng)。在組胺H1受體拮抗劑pyrilamine(30μM)存在的情況下，組胺(30μM)并不能使HMs的膜去極化。但在H2受體拮抗劑cimetidine(30μM)存在的情況下，組胺(30μM)依日能使HM去極化(7.10±0.22 mV, n=7 vs.7.26±0.33 mV, P＞0.05)。H1一受體的特異性激動(dòng)劑2-(2-吡啶基)乙胺(2-pyridylethylamine，2-PyEA)能很好的模

14、仿組胺的作用，但H2受體的特異性激動(dòng)劑dimaprit和組胺H3受體的特異性激動(dòng)劑r-α-methylhistamine均沒(méi)有明顯作用。說(shuō)明只有組胺H1受體介導(dǎo)了組胺的作用。7.組胺效應(yīng)的具體信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。在ACSF中預(yù)先加入PKA和PKC的抑制劑H-89(10μM)和chelerythrine(10μM)，2-PyEA依然產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流(P＞0.05)。但預(yù)先加入PLC-IP3抑制劑U-73122(10μM)后，2-PyEA并不能

15、引起內(nèi)向電流，說(shuō)明組胺作用的信號(hào)通路為H1R/Gq/11/PLC/IP3/Ca2+，PKA和PKC在其中沒(méi)有作用。8.組胺的作用依賴于膜內(nèi)鈣離子和膜外鈉離子。鉀離子通道的廣譜拮抗劑Ba2+(4 mM BaCl2)并不能拮抗2-PyEA的作用(P＞0.05)，HCN的拮抗劑ZD7288(50μM)也不能拮抗2-PyEA的作用。但在Tris-ACSF或無(wú)鈣電極內(nèi)液中，2-PyEA(30μM)引起的內(nèi)向電流明顯減少(P＜0.05)，分別為8.

16、11±4.38 pA(n=7)和36.93±5.49 pA(n=6)。說(shuō)明組胺和2-PyEA的作用不依賴鉀離子和HCN離子通道，只依賴于胞外鈉離子和胞內(nèi)鈣離子濃度，可能通過(guò)鈉鈣交換體的作用引起內(nèi)向電流并最終導(dǎo)致膜去極化。
　　結(jié)論：CIH能不僅能顯著增高下丘腦orexin前體的表達(dá)，并且能明顯增加下丘腦和延髓orexin受體的表達(dá)水平;反之，orexin可以通過(guò)OX1R和OX2R調(diào)節(jié)HMs的興奮性，因此可以推測(cè)orexin在OSA