神經(jīng)營養(yǎng)因子和骨骼肌對DRG神經(jīng)元生長的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、骨骼肌(skeletalmuscle,SKM)同時接受運動和感覺神經(jīng)元的支配，肌梭是一種感受本體感覺的感受器。背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)是初級感覺神經(jīng)元的胞體聚集形成的，這些神經(jīng)元形成中樞部和外周部，在外周神經(jīng)末梢和脊髓之間建立感覺聯(lián)系。體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和肌細胞是目前研究神經(jīng)肌-接頭(neuromuscularjunction，NMJ)的形成、功能及其維持作用的重要手段之一，這種模式還用來研究神經(jīng)-肌功能

2、紊亂、細胞信號轉導、藥物篩選以及生物機器人的研發(fā)等。以往的研究認為，感覺神經(jīng)元只是簡單的跟隨運動神經(jīng)元到達其相應的靶組織，并且感覺神經(jīng)元軸突的生長伴隨運動神經(jīng)元且晚于運動神經(jīng)元。但有研究證實，感覺神經(jīng)元有能力憑借自己的力量到達靶組織而不必借助運動神經(jīng)元的引導。這表明感覺神經(jīng)元在最初的軸突生長的過程中對于靶組織的選擇或識別具有明顯的可塑性。
　　 神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophics，NTs)是神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育和功能維持的重要

3、調(diào)節(jié)因子。神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor,NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)是NTs家族中的成員，外源性給予這些營養(yǎng)因子可以促進已損傷的神經(jīng)元的修復和軸突的再生。神經(jīng)和肌之間NTs和一些分子的交換是神經(jīng)-肌連接進行信息傳遞的物質基礎。神經(jīng)元和靶組織之間各種因子的釋放和接受是兩者之間相互作用、相

4、互影響、相互依存的意義所在。NTs和靶組織SKM細胞對神經(jīng)元功能和神經(jīng)-肌連接的維持具有重要作用。
　　 神經(jīng)元一旦識別到合適的靶組織，就會建立特定的神經(jīng)元和靶組織之間的聯(lián)系，這些聯(lián)系的建立包括突觸生長動力學的調(diào)節(jié)以及功能性連接的形成。因此，本課題利用DRG與SKM細胞進行聯(lián)合培養(yǎng)，觀察DRG神經(jīng)元與靶組織SKM之間建立聯(lián)系即形成神經(jīng)-肌連接的過程，研究在各種實驗條件下，靶組織SKM和NTs對DRG神經(jīng)元生長的調(diào)節(jié)作用。

5、　　 第一部分靶組織骨骼肌對器官型培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元生長和遷移的影響
　　 神經(jīng)元和靶組織之間存在著相互依存的關系。在神經(jīng)元的發(fā)育過程中，神經(jīng)元延伸它的軸突到達相應的靶組織，神經(jīng)元一旦與其支配的靶組織建立了聯(lián)系，便開始依靠靶組織的存活而存活，并由靶組織提供營養(yǎng)支持。當然，神經(jīng)元本身有其自身的生存、發(fā)育和代謝過程，但靶組織對神經(jīng)元的存活所起的作用是毋庸置疑的。有研究證實，在胚胎發(fā)育期，如果失去肢芽的營養(yǎng)作用，感覺神經(jīng)元將出現(xiàn)支配

6、紊亂的現(xiàn)象，甚至失去存活的能力而走向程序性細胞死亡(programmedcelldeat，PCD)。外源性給予SKM提取物或肌球蛋白-2，可以促進神經(jīng)元的存活和感覺神經(jīng)元軸突的分支。有研究顯示，靶組織的炎癥可以抑制已損傷的神經(jīng)元的軸突再生。也有研究顯示，鞘細胞中的多種細胞成分可以產(chǎn)生營養(yǎng)因子促進神經(jīng)元的存活和軸突的生長。
　　 生長相關蛋白43（growth-associatedprotein-43，GAP-43）作為一種神經(jīng)元

7、特異性的鈣結合蛋白和肌動蛋白結合蛋白在突觸前膜有高表達。GAP-43常被用來當作突觸生長發(fā)育和神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生的標志物。感覺神經(jīng)肽在DRG神經(jīng)元表達水平的高低代表DRG神經(jīng)元的功能狀態(tài)變化，其中降鈣素基因相關肽(calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)是由降鈣素基因逆轉錄生成的一種神經(jīng)肽，它可在DRG神經(jīng)元表達，并發(fā)揮多種生物學功能，可參與多種感覺信息的調(diào)節(jié)，并且與肌的活力、血管舒張及炎癥反應等功能的調(diào)

8、節(jié)有關。神經(jīng)絲（neurofilament,NF）是神經(jīng)元特異性中間絲，高分子量神經(jīng)絲（highmolecularmassneurofilament，NF-H）對正常神經(jīng)元的維持發(fā)揮重要作用，神經(jīng)絲蛋白-200(neurofilament-200，NF-200)屬于NF-H。隨著神經(jīng)元的成熟，NF-H的出現(xiàn)是決定軸突穩(wěn)定性的重要細胞內(nèi)事件。DRG神經(jīng)元可根據(jù)神經(jīng)生化免疫反應分為神經(jīng)肽免疫反應(neuropeptide-immunorea

9、ctive，NP-IR)和神經(jīng)絲免疫反應(neurofilament-immunoreactive，NF-IR)神經(jīng)元兩種主要表型。NP-IR神經(jīng)元的突起構成無髓鞘的和薄髓的痛覺傳入纖維，這種纖維主要分布于皮膚和內(nèi)臟，CGRP-IR神經(jīng)元可代表NP-IR神經(jīng)元;NF-IR神經(jīng)元的突起構成有髓神經(jīng)纖維，這些神經(jīng)纖維主要分布于肌梭，NF-200-IR神經(jīng)元可代表NF-IR神經(jīng)元。
　　 靶組織SKM對DRG神經(jīng)元生長和神經(jīng)元表型的變

10、化產(chǎn)生影響的作用及其機制目前仍不清楚。因此，本課題利用器官型DRG和分散SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，研究靶組織SKM對DRG神經(jīng)元突起的生長、神經(jīng)元的遷移、GAP-43、CGRP和NF-200的表達變化。
　　 本實驗選取新生Wistar大鼠（出生后24h以內(nèi)），在無菌條件下取四肢的SKM，經(jīng)消化、離心、過濾后，制成單細胞懸液，種植于包被過多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，進行SKM細胞的分散培養(yǎng)，培養(yǎng)3d至SKM細胞開始出現(xiàn)融合時，取孕15

11、d（embryonicday15，E15）Wistar胚胎大鼠的DRG，在體視顯微鏡下剝?nèi)ド窠?jīng)節(jié)外膜后，種植于多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)或種植于已種植了SKM細胞的培養(yǎng)板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)6d后，進行各種實驗研究。根據(jù)實驗設計，將培養(yǎng)的標本共分為兩組:(1)DRG與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)組:器官型DRG組織塊與分散SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng);(2)DRG單純培養(yǎng)組:器官型DRG組織塊單獨培養(yǎng)。用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察不同培養(yǎng)條件下DRG神經(jīng)元與SKM

12、細胞的生長狀態(tài)，終止培養(yǎng)后用掃描電子顯微鏡技術(scanningelectronmicroscopy,SEM)、免疫熒光雙標技術、Westernblot分析技術和realtime-PCR分析技術對不同培養(yǎng)條件下DRG神經(jīng)元進行檢測，得到以下實驗結果。
　　 (1)器官型DRG組織塊單獨培養(yǎng)或與分散SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)6d后，以DRG組織塊為中心，取右上1/4象限進行神經(jīng)纖維束計數(shù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合培養(yǎng)環(huán)境下DRG神經(jīng)纖維束的數(shù)目明顯高于單

13、純培養(yǎng)環(huán)境中的DRG，并且聯(lián)合培養(yǎng)中的DRG的神經(jīng)纖維束可生長到更遠的距離。
　　 (2)器官型DRG組織塊單獨培養(yǎng)或與分散SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)6d，終止培養(yǎng)后經(jīng)SEM觀察，聯(lián)合培養(yǎng)環(huán)境下由DRG組織塊生長出的神經(jīng)纖維束，與單純培養(yǎng)的DRG相比不僅數(shù)目明顯增加，而且神經(jīng)纖維束更加粗壯。聯(lián)合培養(yǎng)中由DRG組織塊遷出的神經(jīng)元數(shù)目，與單純培養(yǎng)的DRG相比明顯增多，而且遷移的距離較大，有的可達0.5mm以外。聯(lián)合培養(yǎng)中，由DRG組織塊生長

14、出的神經(jīng)纖維可跨越多個肌管表面，在肌管表面形成密集的神經(jīng)纖維網(wǎng)，有的神經(jīng)纖維終末呈末端膨大終止于周圍的肌管表面。聯(lián)合培養(yǎng)中，由DRG組織塊遷出的單個神經(jīng)元分散于肌管之間，并發(fā)出突起越過或終止于肌管表面。
　　 (3)用微管相關蛋白-2(microtubule-associatedprotein2，MAP-2)進行免疫熒光標記由DRG組織塊遷出的神經(jīng)元，在熒光顯微鏡下定量計數(shù)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合培養(yǎng)的DRG組織塊遷出的神經(jīng)元明顯多于單純培養(yǎng)

15、的DRG。
　　 (4)對遷出的神經(jīng)元進行MAP-2和GAP-43、CGRP或NF-200免疫熒光雙標記，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合培養(yǎng)中DRG遷出的GAP-43-IR神經(jīng)元和NF-200-IR神經(jīng)元的比例明顯高于單純培養(yǎng)中的DRG，而CGRP-IR神經(jīng)元的比例則沒有變化。
　　 (5)經(jīng)Westernblot和realtime-PCR分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合培養(yǎng)的DRG內(nèi)GAP-43和NF-200及其mRNA的表達均顯著增加。
　　 以上

16、結果顯示，在器官型DRG和分散SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)中，由DRG組織塊生長出的神經(jīng)纖維以及由DRG組織塊遷出的神經(jīng)元生長出的神經(jīng)突起均可與肌管之間形成神經(jīng)-肌連接樣結構。聯(lián)合培養(yǎng)中，靶組織SKM可促進DRG神經(jīng)元的生長與遷移，而且能促進NF-IR神經(jīng)元表型的表達，而對NP-IR神經(jīng)元表型的影響作用不明顯。這表明聯(lián)合培養(yǎng)中，DRG神經(jīng)元和SKM之間不僅具有形態(tài)學上的神經(jīng)-肌連接的建立，而且靶組織SKM對DRG神經(jīng)元的促生長作用及特定表型的影響

17、作用表明DRG神經(jīng)元與SKM之間具有功能性的相互作用關系。
　　 第二部分神經(jīng)營養(yǎng)因子對DRG神經(jīng)元與骨骼肌聯(lián)合培養(yǎng)中生長相關蛋白-43表達的影響
　　 對NTs敏感的神經(jīng)元所支配的靶組織對神經(jīng)元的存活和分化有重要作用。有研究證實感覺保護可以通過調(diào)節(jié)SKM內(nèi)NTs的合成，從而提供一個良好的微環(huán)境。靶組織可以調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)元的功能和表型。在軸突再生的過程中，GAP-43選擇性的表達在發(fā)育中的神經(jīng)元的軸突。周圍神經(jīng)損傷后，GA

18、P-43在損傷的神經(jīng)和DRG內(nèi)都有表達。在培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元，NGF和BDNF等NTs可以影響GAP-43的表達，GAP-43對生長錐的形成和軸突的生長發(fā)揮重要的作用。具有靶組織聯(lián)系的DRG神經(jīng)元，與沒有靶組織聯(lián)系的DRG神經(jīng)元相比，其生長過程中的可塑性變化可能是不同的。各種NTs是否對具有靶組織聯(lián)系的DRG神經(jīng)元GAP-43的表達產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用目前仍不清楚。本課題利用分散的DRG神經(jīng)元與SKM細胞進行聯(lián)合培養(yǎng)，研究NGF、BDNF和NT

19、-3對DRG神經(jīng)元GAP-43表達的影響作用。
　　 本實驗利用新生Wistar大鼠（出生后24h以內(nèi)）四肢的SKM，經(jīng)消化、離心、過濾后，制成單細胞懸液，種植在包被過多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，進行SKM細胞的分散培養(yǎng)，培養(yǎng)3d，SKM細胞開始出現(xiàn)融合時，取E15Wistar大鼠胚胎的DRG，經(jīng)消化、離心和過濾后制成單細胞懸液，接種于含有SKM細胞的培養(yǎng)板內(nèi)，根據(jù)實驗設計分為4組:(1)NGF組:用NGF(終濃度為10ng/ml)孵

20、育6d;(2)BDNF組:用BDNF(終濃度為10ng/ml)孵育6d;(3)NT-3組:用NT-3（終濃度為10ng/ml）孵育6d;(4)對照組:不施加任何干擾因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)6d。終止培養(yǎng)后，用SEM、免疫熒光雙標技術、Westernblot分析技術和realtime-PCR分析技術等各種實驗手段進行檢測，得到以下結果。
　　 (1)SEM觀察顯示，與對照組相比，經(jīng)NGF、BDNF和NT-3孵育的聯(lián)合培養(yǎng)標本，單個

21、DRG神經(jīng)元發(fā)出的突起數(shù)目較多，從1～5個不等，在單層分散的SKM細胞表面形成纖維網(wǎng)，有的突起在行程中有膨體樣結構，有的突起末端變細，有的突起的末端會出現(xiàn)膨大樣改變，終止于SKM表面。
　　 (2)免疫熒光雙標記、Westernblot和realtime-PCR分析結果顯示，與對照組相比，經(jīng)NGF、BDNF和NT-3孵育的聯(lián)合培養(yǎng)標本，GAP-43-IR神經(jīng)元的比例、GAP-43蛋白水平及GAP-43mRNA水平顯著增加。

22、>　　 以上結果表明，外源性NGF、BDNF和NT-3可對分散的DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)中神經(jīng)元突起的生長具有明顯的促進作用，這種作用可能與GAP-43的表達上調(diào)有關。外源性NGF、BDNF和NT-3對DRG神經(jīng)元突起生長的促進作用可能與特定的NTs改善DRG神經(jīng)元再生的微環(huán)境有關。不同的NTs對不同亞群的DRG神經(jīng)元的特定影響作用尚有待于進一步探討。
　　 第三部分NGF或NT-3對DRG神經(jīng)元與骨骼肌聯(lián)合培養(yǎng)中PP

23、T、CGRP、NF-200和MAP-2mRNA表達的影響
　　 特定的NTs除了促進DRG神經(jīng)元生長以外，還可能會影響DRG神經(jīng)元多種神經(jīng)遞質的合成和蛋白的表達。P物質(substanceP，SP)和CGRP均為在DRG神經(jīng)元表達的肽類神經(jīng)遞質，與血管的舒縮活動和感覺信息的傳遞有關。NF-200屬NF-H，對正常神經(jīng)元功能的維持有重要作用。MAP-2短暫性參與神經(jīng)元的生長和細胞極性的形成，與微管、NF和肌動蛋白相互作用，來維持神

24、經(jīng)元細胞骨架的穩(wěn)定性。為了進一步檢測特定的NTs對DRG神經(jīng)元內(nèi)這些物質表達的影響作用，本課題利用分散的DRG神經(jīng)元與SKM細胞進行聯(lián)合培養(yǎng)，研究NGF和NT-3對DRG神經(jīng)元內(nèi)編碼SP的前速激肽原(preprotachykinin,PPT)mRNA、CGRPmRNA、NF-200mRNA和MAP-2mRNA表達的影響作用。
　　 實驗中細胞聯(lián)合培養(yǎng)的步驟與第二部分相同。根據(jù)實驗設計分為3組:(1)NGF組:用NGF(終濃度為1

25、0ng/ml)孵育6d;(2)NT-3組:用NT-3（終濃度為10ng/ml）孵育6d;(3)對照組:不施加任何干擾因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)6d。終止培養(yǎng)后，用realtime-PCR技術檢測PPT、CGRP、NF-200和MAP-2mRNA表達。結果顯示，NGF和NT-3均可促進聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元PPT、CGRP和NF-200mRNA的表達，而對MAP-2mRNA的表達沒有明顯的影響作用。NGF和NT-3對聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元P

26、PT和CGRPmRNA表達的促進作用表明特定的NTs可促進DRG神經(jīng)元肽類感覺神經(jīng)遞質的發(fā)育或成熟;NGF和NT-3對聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元NF-200mRNA表達的促進作用表明特定的NTs與DRG感覺神經(jīng)元發(fā)育晚期的細胞內(nèi)事件有關;NGF和NT-3對聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元MAP-2mRNA表達無顯著影響表明DRG神經(jīng)元本身或靶組織SKM細胞存在的影響足以觸發(fā)MAP-2mRNA的表達，而不依賴于外源性特定NTs的存在。NGF和NT-3對