GM1、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和骨骼肌對(duì)DRG神經(jīng)元表型影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)肽免疫反應(yīng)（neuropeptide-immunoreactive，NP-IR）神經(jīng)元和神經(jīng)絲免疫反應(yīng)（neurofilament-immunoreactive，NF-IR）神經(jīng)元是背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元的兩個(gè)主要表型。NP-IR神經(jīng)元周?chē)粚儆跓o(wú)髓或薄髓纖維，分布于內(nèi)臟和皮膚，可以合成并釋放P物質(zhì)（substance P， SP）等生物活性物質(zhì)。NF-IR神經(jīng)元周?chē)粍t屬于有髓纖維，分

2、布于肌梭，主要參與牽張反射刺激，與本體感覺(jué)的信息傳遞有關(guān)。SP是DRG神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元的胞體內(nèi)合成，經(jīng)軸突運(yùn)輸至神經(jīng)末梢，在炎癥、應(yīng)激等刺激下釋放，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。神經(jīng)絲是神經(jīng)元細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要組成部分，參與維持神經(jīng)元正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。神經(jīng)絲主要有輕（NF-L）、中（NF-M）、重（NF-H）三種亞型，其分子量分別為68 kDa，160 kDa和200 kDa。神經(jīng)絲-200（neurofilament200，NF-20

3、0）是構(gòu)成軸突的主要骨架結(jié)構(gòu)，在DRG神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中有表達(dá)，是NF-IR神經(jīng)元表型的一個(gè)重要指標(biāo)。 單涎性神經(jīng)節(jié)苷脂（monosiaganglioside， GM1）在神經(jīng)元的發(fā)育，分化和存活等生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下均具有營(yíng)養(yǎng)作用。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)皆表明，GM1可以發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子樣作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，神經(jīng)元誘導(dǎo)分化過(guò)程中伴隨著GM1生物合成的改變和核膜GM1含量的增高。 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neurotrophins，NTs）

4、在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和存活中具有重要的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor， NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3（neurotrophin-3，NT-3）都是NTs家族的成員。研究表明，外源性應(yīng)用這些營(yíng)養(yǎng)因子可以保護(hù)受損神經(jīng)元，刺激軸突再生。 NGF在感覺(jué)神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程中，對(duì)于初級(jí)傳入神經(jīng)元的存活和表型的形成

5、具有重要的影響作用。體外培養(yǎng)成年DRG感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，部分DRG感覺(jué)神經(jīng)元的神經(jīng)肽表型是固有的，并且其表犁的表達(dá)程度可以由NGF來(lái)調(diào)節(jié)。在DRG神經(jīng)元受損時(shí)，NGF還可以逆轉(zhuǎn)具有高親和力NGF受體的DRG神經(jīng)元中神經(jīng)絲mRNA的減少。 BDNF在中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)和分化。在DRG感覺(jué)神經(jīng)元中，BDNF主要存在于小型和中型亞群DRG感覺(jué)神經(jīng)元，可以順向轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元的周?chē)缓椭?/p>

6、樞突。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，BDNF的存在對(duì)于DRG感覺(jué)神經(jīng)元的存活和功能的維持具有非常重要的作用。體外實(shí)驗(yàn)也表明，部分感覺(jué)神經(jīng)元的存活依賴(lài)于BDNF的存在。 NT-3可作為促細(xì)胞分裂因子或誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的因子，維持胚胎發(fā)育中神經(jīng)元的存活，并促進(jìn)其分化與增殖。NT-3在感覺(jué)神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的存活和分化，以及神經(jīng)突起發(fā)生、突觸形成和軸突生長(zhǎng)中均具有非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，DRG感覺(jué)神經(jīng)元可能是脊髓神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如NT-3的來(lái)源之一，并

7、且在脊髓損傷后DRG感覺(jué)神經(jīng)元內(nèi)的NT-3可以順行轉(zhuǎn)運(yùn)至脊髓，有利于脊髓神經(jīng)元的再生。 靶組織在維持神經(jīng)元的功能和神經(jīng)-肌間的信息傳遞中，發(fā)揮著重要作用。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與其支配的骨骼肌（skeletal muscle，SKM）之間具有密切的相互依賴(lài)關(guān)系。兩種組織之間的重要信息傳遞是由神經(jīng)-肌接頭（neuromuscular junction，NMJ）介導(dǎo)的。在這兩種組織的其它部位釋放和接收各種因子也是它們之間相互影響的一種方式。神經(jīng)

8、.肌之間的信息傳遞之一是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和其他分子的相互交換。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新生哺乳動(dòng)物NF-IR陽(yáng)性DRG神經(jīng)元，需要SKM提取物中的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)維持其存活。實(shí)驗(yàn)表明，在神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程中，靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)于支配肌細(xì)胞的不同神經(jīng)元的存活和分化具有重要的生物學(xué)作用。感覺(jué)神經(jīng)末梢可以為去神經(jīng)支配肌組織提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，SKM的肌梭也受DRG感覺(jué)神經(jīng)元支配。 GM1、NGF、BDNF、NT-3和靶組織SKM對(duì)維持神經(jīng)元的功能

9、都發(fā)揮重要的作用。然而，GM1、NGF、BDNF、NT-3單獨(dú)應(yīng)用或與靶組織SKM聯(lián)合應(yīng)用是否影響DRG感覺(jué)神經(jīng)元的表型目前尚不清楚?；谝陨涎芯勘尘?，本研究在體外建立DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)和DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞模型，通過(guò)檢測(cè)體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中SP-IR和NF-200-IR神經(jīng)元的表達(dá)情況，來(lái)分析GMI、NGF、BDNF、NT-3和SKM細(xì)胞單獨(dú)應(yīng)用以及GM1、NGF、BDNF、NT-3分別與SKM細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對(duì)D

10、RG神經(jīng)元表型的影響作用，為初級(jí)傳入神經(jīng)元表型變化的發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分GM1和骨骼肌對(duì)培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元表型的影響作用 胚胎第12.5天（embryonic day12.5，E12.5）和胚胎第19.5天（embryonic day19.5，E19.5）的大鼠DRG神經(jīng)元，分別進(jìn)行體外單純分散培養(yǎng)以及與SKM細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)，體外培養(yǎng)2d后，分為8組。（1）E12.5對(duì)照組：E12.5DRG神

11、經(jīng)元單純培養(yǎng)，不施加任何干預(yù)因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4d；（2）E19.5對(duì)照組：E19.5DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)，不施加任何干預(yù)因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4 d；（3）E12.5GM1組：E12.5DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)，用GM1（終濃度10μg/ml）孵育4 d；（4）E19.5GM1組：E19.5DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)，用GM1（終濃度10μg/ml）孵育4 d；（5）E12.5SKM組：E12.5DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，不施加

12、任何干預(yù)因素，繼續(xù)培養(yǎng)4 d；（6）E19.5SKM組：E19.5DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，不施加任何干預(yù)因素，繼續(xù)培養(yǎng)4 d：（7）E12.5GM1+SKM組：E12.5DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，用GM1（終濃度10μg/ml）孵育4 d；（8）E19.5GM1+SKM組：E19.5DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，用GMI（終濃度10μg/ml）孵育4d。在培養(yǎng)過(guò)程中，用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察各組標(biāo)本在不同時(shí)間的生長(zhǎng)

13、狀態(tài)。終止培養(yǎng)后，用掃描電子顯微鏡觀察單純培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元胞體、突起及神經(jīng)末梢的形態(tài)以及聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元胞體、突起的形態(tài)以及神經(jīng)末梢與SKM之間的關(guān)系；用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)來(lái)檢測(cè)單純培養(yǎng)和聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元中SP-IR和NF-200-IR神經(jīng)元的表達(dá)變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： （1）倒置相差顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DRG神經(jīng)元的突起跨過(guò)SKM細(xì)胞或者到達(dá)并分布于SKM細(xì)胞表面，在SKM細(xì)胞自發(fā)性收縮的牽動(dòng)下，

14、DRG神經(jīng)元的突起也隨之移動(dòng)。 （2）GM1可以促進(jìn)體外分散培養(yǎng)的E12.5DRG神經(jīng)元中SP和NF-200的表達(dá)（P<0.05），而不能促進(jìn)體外分散培養(yǎng)的E19.5DRG神經(jīng)元中SP和NF-200的表達(dá)。 （3）靶組織SKM細(xì)胞可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的E12.5 DRG神經(jīng)元中NF-200的表達(dá)（P<0.05）而不能促進(jìn)SP的表達(dá)；靶組織SKM細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)的E19.5DRG神經(jīng)元中SP和NF-200的表達(dá)無(wú)影響作用。 （

15、4）GM1和靶組織SKM細(xì)胞對(duì)促進(jìn)E12.5DRG神經(jīng)元SP和NF-200的表達(dá)具有協(xié)同作用（P<0.001）；而GM1和靶組織SKM細(xì)胞對(duì)E19.5DRG神經(jīng)元SP和NF-200的表達(dá)無(wú)影響作用。 第二部分神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和骨骼肌對(duì)培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元表型的影響作用 體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元取自Wistar大鼠第12.5 d的胚胎。無(wú)菌條件下進(jìn)行體外DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)以及與SKM細(xì)胞的體外聯(lián)合培養(yǎng)，體外培養(yǎng)2d后，分為8組。

16、（1）對(duì)照組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，不施加任何干預(yù)因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4d；（2）NGF組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，用NGF（10 ng/ml）孵育4d；（3）BDNF組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，用BDNF（10 ng/ml）孵育4d；（4）NT-3組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，用NT-3（10 ng/ml）孵育4d；（5）SKM組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，不施加任何干預(yù)因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4 d；

17、（6）SKM+NGF組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，用NGF（10 ng/ml）孵育4 d；（7）SKM+BDNF組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，用BDNF（10 ng/ml）孵育4 d；（8）SKM+NT-3組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，用NT-3（10 ng/ml）孵育4d。在培養(yǎng)過(guò)程中，用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察各組標(biāo)本在不同時(shí)間的生長(zhǎng)狀態(tài)。終止培養(yǎng)后，用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)單純和聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)