激活TRPV4受體對成年海馬齒回神經(jīng)再生的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、研究背景:成年哺乳動物腦內(nèi)的神經(jīng)再生(adult neurogenesis)對于維持腦的正常功能具有重要意義。神經(jīng)再生過程主要包括干細(xì)胞的增殖、前體細(xì)胞的存活和分化、新生神經(jīng)元的成熟、突觸形成和神經(jīng)回路整合等幾個(gè)階段。鈣離子(calcium，Ca2+)作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在細(xì)胞的增殖、發(fā)育、遷移和存活等多個(gè)過程中起重要調(diào)節(jié)作用。瞬時(shí)感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型（TRPV4）是瞬時(shí)感受器電位(TRP)受體家族成員之一。TRPV4受

2、體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的海馬、大腦皮層、丘腦和小腦等腦區(qū)。TRPV4受體是一種對Ca2+具有選擇通透性的陽離子通道，激活TRPV4受體可引起胞內(nèi)游離鈣離子水平([Ca2+]i)升高。TRPV4受體激活后可通過其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流促進(jìn)豬內(nèi)皮細(xì)胞、食管內(nèi)皮細(xì)胞和人腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。此外，[Ca2+]i水平對神經(jīng)元的突起生長起重要調(diào)節(jié)作用，[Ca2+]i過高或過低都能顯著抑制神經(jīng)元的軸突延伸和樹突發(fā)育。TRPV4受體功能獲得性基因突

3、變所致的[Ca2+]i升高在周圍運(yùn)動神經(jīng)元軸突病變過程中起著重要的作用。然而，目前尚無有關(guān)TRPV4受體調(diào)控成年海馬神經(jīng)再生的相關(guān)報(bào)道。
　　絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活等過程中起重要調(diào)控作用。在肺內(nèi)皮細(xì)胞、三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及海馬神經(jīng)元上的研究發(fā)現(xiàn)，TRPV4受體激活后能夠上調(diào)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和p38 MAPK信號通路。AMP激活的蛋

4、白激酶(AMPK)是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，AMPK激活后通過作用于下游一系列與突起生長有關(guān)的信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞骨架降解，抑制神經(jīng)突起生長。蛋白激酶B(Akt)通過調(diào)節(jié)其下游的信號分子如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和糖原合成酶激酶3β（GSSK3β）的活性在神經(jīng)元突起生長過程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，急性激活TRPV4受體可通過其介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流影響AMPK-Akt信號通路的活性。
　　基于上述報(bào)道和前

5、期研究，本課題提出激活TRPV4受體可能通過MAPK或AMPK-Akt信號通路調(diào)節(jié)成年海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞增殖和新生神經(jīng)元突起生長，為調(diào)控成年海馬神經(jīng)再生提供新靶點(diǎn)。
　　研究目的:
　　1.明確激活TRPV4受體對海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制。
　　2.明確激活TRPV4受體對海馬齒回新生神經(jīng)元突起生長的作用及其機(jī)制。
　　第一部分激活TRPV4受體對成年海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用及其分子機(jī)制
　

6、　材料與方法:
　　1.制備TRPV4受體激活的在體模型:側(cè)腦室注射不同劑量的TRPV4受體激動劑GSK1叭6790A，制備TRPV4受體激活的在體模型。
　　2.免疫組織化學(xué)染色:5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）用PBS溶解后按照每只小鼠50 mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射3次，間隔8h，標(biāo)記有絲分裂的細(xì)胞。小鼠用水合氯醛腹腔麻醉（400 mg/kg）后，先后用PBS和4％多聚甲

7、醛進(jìn)行心臟灌流固定，取腦組織后于4％多聚甲醛固定液(4℃)中固定48 h。選擇海馬部位，用振動切片機(jī)進(jìn)行冠狀連續(xù)切片，進(jìn)行BrdU和Ki67免疫組織化學(xué)染色，檢測激活TRPV4受體對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用。
　　3.蛋白印跡(Western blot):檢測GSK1016790A對海馬組織目標(biāo)蛋白的作用。
　　結(jié)果:
　　1.給予GSK1016790A能增加海馬齒回SGZ區(qū)1天齡BrdU陽性細(xì)胞(1-day-old Br

8、dU+)和Ki67陽性細(xì)胞(Ki67+)數(shù)目，增加增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的蛋白水平。
　　2.給予GSK1016790A能顯著增加海馬組織周期素依賴性激酶2(CDK2)和CDK6，周期素E1(cyclin E1)和cyclin A2，以及磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(p-Rb)的蛋白水平，但對CDK4和cyclin D1蛋白水平無顯著影響。
　　3.給予GSK1016790A能顯著增加海馬組織磷酸化ERK1/2(p-ERK1

9、/2)和磷酸化p38 MAPK(p-p38MAPK)蛋白水平。
　　4.絲裂素活化蛋白激酶激酶(MEK)的抑制劑U0126或p38 MAPK特異性抑制劑SB203580能顯著降低GSK1016790A注射組小鼠1-day-old BrdU+和Ki67+細(xì)胞數(shù)目及PCNA蛋白水平。給予U0126或SB203580能明顯降低GSK1016790A注射組小鼠CDK2和CDK6，cyclin E1和cyclin A2，以及p-Rb蛋白水平

10、。
　　結(jié)論:激活TRPV4受體可通過增強(qiáng)ERK和p38 MAPK信號通路增加細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK2、CDK6和cyclin E1、cyclin A2表達(dá)，提高Rb的磷酸化水平，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)成年海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
　　第二部分激活TRPV4受體對成年小鼠海馬齒回新生神經(jīng)元突起生長的作用及分子機(jī)制
　　材料與方法
　　1.制備TRPV4受體激活的在體模型:側(cè)腦室注射不同濃度劑量的TRPV4受體激動

11、劑GSK1016790A，制備激活TRPV4受體的在體模型。
　　2.免疫組織化學(xué)染色:小鼠用水合氯醛腹腔麻醉(400 mg/kg)后，先后用PBS和4％多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定，取腦組織后于4％多聚甲醛固定液(4℃)中后固定48 h。選擇海馬部位，用振動切片機(jī)進(jìn)行冠狀連續(xù)切片，進(jìn)行雙皮質(zhì)素(DCX)免疫組織化學(xué)染色，檢測激活TRPV4受體對新生神經(jīng)元突起生長的作用。
　　3.蛋白印跡(Western blot):檢測GSK

12、1016790A對海馬組織目標(biāo)蛋白表達(dá)的作用。
　　結(jié)果
　　1.側(cè)腦室注射GSK1016790A能顯著降低成年小鼠海馬齒回DCX陽性細(xì)胞(DCX+)及突起數(shù)目。
　　2.給予GSK1016790A30 min至2h磷酸化AMPK(p-AMPK)的蛋白水平顯著增加;給予GSK1016790A1 d至5 d p-AMPK蛋白水平顯著降低;給予GSK1016790A30 rnin至5 d磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平

13、顯著降低。給予AMPK抑制劑compound C能明顯阻斷GSK1016790A降低p-Akt蛋白水平的作用，而給予AMPK激動劑AICAR則無此作用。
　　3.給予GSK1016790A能夠明顯降低磷酸化mTOR(p-mTOR)和磷酸化70kDa核糖體蛋白S6激酶(p-p70S6K)的蛋白水平;給予磷酸肌醇3激酶的激動劑740 Y-P或compound C能有效阻斷GSK1016790A的上述作用。給予GSK1016790A能夠

14、顯著增加磷酸化GSK3β(Y216)位點(diǎn)(p-GSK3βY216)的蛋白水平、磷酸化微管相關(guān)蛋白2(p-MAP2)和磷酸化坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(p-CRMP-2)的水平;給予740 Y-P或compound C能有效阻斷GSK1016790A增加p-GSK3βY216、p-MAP2和p-CRMP-2蛋白水平的作用。
　　4.給予compound C或740 Y-P能顯著增加GSK1016790A注射組小鼠海馬齒回DCX+細(xì)胞及神經(jīng)突