Lhx8在海馬膽堿能神經(jīng)再生中的作用.pdf

1、LIM同源盒基因（LIM homeobox gene）家族成員之一的Lhx8與胚胎時(shí)期膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育有關(guān)，但是對(duì)于其在海馬膽堿能神經(jīng)再生中的作用及誘導(dǎo)其上調(diào)的機(jī)制尚未見有報(bào)道。本課題研究?jī)?nèi)容主要包括四個(gè)方面：
　　1、切割穹窿海馬傘后海馬內(nèi)Lhx8的表達(dá)變化及與ChAT陽性神經(jīng)元的共定位；
　　2、過表達(dá)Lhx8促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化；
　　3、沉默Lhx8抑制海馬神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化；

2、>　　4、NGF上調(diào)Lhx8促進(jìn)海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化的信號(hào)通路研究。
　　一．目的：
　　觀察切割穹窿海馬傘后Lhx8蛋白表達(dá)的時(shí)相變化及與ChAT的表達(dá)共定位情況，過表達(dá)和沉默Lhx8后對(duì)NSCs分化為膽堿能神經(jīng)元的影響，明確Lhx8與海馬膽堿能神經(jīng)再生是否有關(guān)；探討NGF上調(diào)Lhx8促進(jìn)海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化的可能信號(hào)通路。
　　二．方法：
　　（1）制備切割右側(cè)穹窿海馬傘大鼠模型，分別于術(shù)

3、后第1d、3d、7d、14d、21d、28d檢測(cè)Lhx8蛋白表達(dá)情況，并檢測(cè)Lhx8蛋白表達(dá)量最高的第7d時(shí)Lhx8與ChAT的共定位情況；
　?。?）體外培養(yǎng)海馬NSCs，并加入切割穹窿海馬傘海馬提取液，將Lenti6.3-Lhx8重組慢病毒轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的細(xì)胞中，觀察海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化情況，檢測(cè)Lhx8和ChAT的基因和蛋白表達(dá)變化；
　　（3）將Lenti6.3-Lhx8重組慢病毒注入正常側(cè)及切割穹窿海馬傘側(cè)大

4、鼠海馬齒狀回中，觀察海馬齒狀回中新生ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元的表達(dá)和定位，檢測(cè)Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)情況；
　?。?）聯(lián)合應(yīng)用切割穹窿海馬傘海馬提取液及NGF培養(yǎng)海馬NSCs，轉(zhuǎn)染Lhx8干擾慢病毒，觀察海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化情況，并檢測(cè)Lhx8和ChAT的基因和蛋白表達(dá)變化；
　?。?）大鼠側(cè)腦室灌注NGF提高海馬ChAT活性，將Lhx8干擾慢病毒分別注入正常側(cè)及切割穹窿海馬傘側(cè)大鼠海馬齒狀回中，觀

5、察海馬齒狀回中新生ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元的表達(dá)和定位，檢測(cè)Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)情況；
　　（6）應(yīng)用NGF促進(jìn)體外培養(yǎng)海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化，加入信號(hào)通路抑制劑，檢測(cè)各通路中效應(yīng)蛋白磷酸化水平、Lhx8基因和蛋白表達(dá)變化，觀察使用信號(hào)通路抑制劑后海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化情況。
　　三．結(jié)果：
　?。?）切割穹窿海馬傘后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，Lhx8蛋白的表達(dá)量逐步增高，且第7d時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到

6、高峰，此后逐漸下降。切割穹窿海馬傘后第7天海馬齒狀回顆粒下層和門區(qū)中出現(xiàn) Lhx8陽性細(xì)胞，其數(shù)量和平均光密度明顯高于正常側(cè)，同時(shí)出現(xiàn)Lhx8/ChAT雙標(biāo)陽性細(xì)胞；
　?。?）海馬NSCs轉(zhuǎn)染Lenti6.3-Lhx8重組慢病毒后，分化為MAP2陽性神經(jīng)元的數(shù)量沒有明顯增加，但能提高ChAT陽性細(xì)胞占 MAP2陽性神經(jīng)元的比例，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)量也明顯增高，說明上調(diào)Lhx8能夠促進(jìn)海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分

7、化；
　　（3）重組慢病毒Lenti6.3-Lhx8能明顯提高正常海馬齒狀回內(nèi)新生的ChAT/Lhx8陽性膽堿能神經(jīng)元數(shù)量，將Lenti6.3-Lhx8重組慢病毒注射至切割穹窿海馬傘海馬齒狀回中，發(fā)現(xiàn)新生的Lhx8陽性的膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量更多，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)量也明顯增高，說明切割穹窿海馬傘且上調(diào) Lhx8，可明顯地促進(jìn)海馬內(nèi)的膽堿能神經(jīng)再生水平；
　　（4）海馬NSCs轉(zhuǎn)染Lhx8干擾慢病毒后，分化為C

8、hAT陽性的膽堿能神經(jīng)元占MAP2陽性神經(jīng)元比例顯著下調(diào)，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)量也明顯降低，說明下調(diào)Lhx8能夠影響培養(yǎng)的海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化；
　?。?）切割穹窿海馬傘并側(cè)腦室灌注NGF后，將Lhx8干擾慢病毒注入海馬，能明顯降低海馬齒狀回中ChAT/Lhx8陽性的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量，Lhx8和ChAT的基因及蛋白的表達(dá)量也明顯降低，說明下調(diào)Lhx8可抑制海馬內(nèi)NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化；
　　（6

9、）NGF作用于培養(yǎng)的海馬NSCs后，AKT，IKB，NFκB，p38MAPK的磷酸化水平上調(diào)；給予相應(yīng)信號(hào)通路抑制劑后，Lhx8的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，且以NFκB信號(hào)通路抑制劑BAY117082組下降最顯著，聯(lián)合應(yīng)用各阻斷劑并沒有協(xié)同作用；給予NFκB信號(hào)通路阻斷后顯著影響海馬NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化。
　　四．結(jié)論：
　　（1）切割穹窿海馬傘后Lhx8蛋白表達(dá)水平先上調(diào)后降低，7d時(shí)達(dá)高峰，且在海馬齒狀回顆粒下層

10、和門區(qū)中出現(xiàn)Lhx8陽性的膽堿能神經(jīng)元，推測(cè)Lhx8可能與海馬的膽堿能神經(jīng)再生有關(guān)；
　?。?）過表達(dá)Lhx8不影響體外培養(yǎng)的海馬源性NSCs向神經(jīng)元分化，但能提高分化神經(jīng)元中膽堿能神經(jīng)元的比例。重組慢病毒 Lenti6.3-Lhx8注入海馬齒狀回能促進(jìn)切割穹窿海馬傘后海馬內(nèi)的膽堿能神經(jīng)再生；
　?。?）Lhx8基因沉默后影響體外培養(yǎng)的海馬源性NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化。使用NGF提高海馬齒狀回區(qū)域ChAT活性，注入Lhx8