基底前腦膽堿能神經(jīng)元在睡眠覺醒中的作用研究.pdf

1、背景和目的:睡眠與覺醒是腦的高級功能，是人體所必需的生理節(jié)律性活動。睡眠障礙或者睡眠剝奪會引起負(fù)面情緒，甚至引發(fā)重大神經(jīng)精神疾病。嚙齒類動物的睡眠覺醒節(jié)律是白天睡眠居多，為非活動期(inactive period)，晚上較為活躍，為活動期(active period)。根據(jù)腦電（electroencephalographic，EEG）和肌電(electromyographic，EMG)記錄可以將動物的睡眠狀態(tài)分為慢波睡眠(slow-wa

2、vesleep，SWS)和快速動眼（rapid eye movement，REM）睡眠。腦內(nèi)和睡眠覺醒相關(guān)的核團(tuán)有很多，基底前腦(basal forebrain，BF)是位于端腦和間腦腹側(cè)的一些結(jié)構(gòu)，包括無名質(zhì)(substantia innominata，SI)、斜角帶核(nucleus of the horizontal limb ofthe diagonal band，HDB)、大細(xì)胞視前核(magnocellular preopt

3、ic nucleus，MCPO)等，它們向皮層發(fā)出的膽堿能投射形成了皮層膽堿能的主要來源。BF腦區(qū)有5％的膽堿能神經(jīng)元、35％的GABA能神經(jīng)元和55％的谷氨酸能神經(jīng)元。先前有研究認(rèn)為BF內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元與清醒或REM睡眠時的皮層活躍度增高有關(guān)。
　　由于研究手段的限制，過去的研究一般使用電刺激和給藥兩種方法來激活或者毀損BF膽堿能系統(tǒng)。電刺激的特異性很差，無法做到只激活膽堿能神經(jīng)元而不激活其它類型的神經(jīng)元。在研究大小鼠的睡眠與覺

4、醒時，由于大小鼠的睡眠覺醒狀態(tài)轉(zhuǎn)換很快（與人類很不同），一個睡眠時相或覺醒狀態(tài)的維持往往只有幾分鐘，故用藥物注射無法研究動物睡眠覺醒狀態(tài)的即時改變。所以傳統(tǒng)的研究手段對于研究BF內(nèi)的只占5％的膽堿能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)睡眠覺醒的中的確切作用和機(jī)制存在較大的爭議。
　　光遺傳學(xué)(optogenetics)采用基因操作技術(shù)將光敏感基因，比如channelrhodopsin2(ChR2)、archearhodopsin(Arch)等轉(zhuǎn)入到神經(jīng)系

5、統(tǒng)特定類型的細(xì)胞中進(jìn)行離子通道的表達(dá)。光感離子通道在不同波長的光照刺激下會分別對陽離子或者陰離子的通過產(chǎn)生選擇性，從而造成細(xì)胞膜兩邊的膜電位發(fā)生變化，達(dá)到對細(xì)胞選擇性地興奮或者抑制的目的。光遺傳技術(shù)具有獨(dú)特的高時空分辨率和細(xì)胞類型特異性，克服了傳統(tǒng)手段控制細(xì)胞或有機(jī)體活動的許多缺點(diǎn)，故能對神經(jīng)元進(jìn)行非侵入式的精準(zhǔn)定位刺激操作。
　　為了更加準(zhǔn)確的研究BF的膽堿能神經(jīng)元在自然覺醒睡眠中的作用，我們把光遺傳學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)的電生理技術(shù)相結(jié)

6、合，選擇性激活ChAT-ChR2-EYFP轉(zhuǎn)基因小鼠（ChAT-ChR2 mice）的膽堿能神經(jīng)元以及抑制ChAT-Arch-GFP小鼠(ChAT-Archmice)的膽堿能神經(jīng)元，特異地改變膽堿能神經(jīng)元的活動，從而研究BF的膽堿能神經(jīng)元對睡眠覺醒活動的快速調(diào)節(jié)作用以及對睡眠節(jié)律和穩(wěn)態(tài)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)驗(yàn)研究對象主要為ChAT-ChR2和ChAT-Arch小鼠。ChAT-Arch小鼠是通過ROSA-Arch-GFP小鼠與C

7、hAT-Cre小鼠雜交獲得，并進(jìn)行PCR基因型鑒定。離體電生理實(shí)驗(yàn)采用出生后4周的ChAT-Arch小鼠，斷頭取腦之后進(jìn)行300μm的冠狀切片然后全細(xì)胞記錄，電壓鉗模式記錄細(xì)胞膜電流反應(yīng)，電流鉗模式記錄細(xì)胞膜電位反應(yīng)。在體實(shí)驗(yàn)采用25～30g雄性小鼠，1％的戊巴比妥鈉(100mg/kg)腹腔注射，并在腦立體定位儀上固定。將光纖套管插入到BF，光纖刺激位置為:anteroposterior(AP):-0.7 mm,mediolateral

8、(ML):1.6 mm,dorsoventral(DV):4.5 mm，同時將EEG/電極植入到小鼠的前額葉皮層對應(yīng)的顱骨表面，電極記錄位置為:AP:+2.0 mm，ML:1.0 mm;將EMG電極插入到小鼠頸部肌肉內(nèi)。動物恢復(fù)箱內(nèi)恢復(fù)1周后轉(zhuǎn)移至記錄箱內(nèi)，連接數(shù)據(jù)記錄線記錄EEG/EMG，用刺激器控制激光器產(chǎn)生光刺激。采用473nm的藍(lán)光刺激ChAT-ChR2小鼠，589nm的黃光刺激ChAT-Arch小鼠，光纖尖部所測得的光功率為0

9、.5-1.5 mW。離體腦片實(shí)驗(yàn)中黃光光照為持續(xù)脈沖刺激或20 ms脈沖刺激，刺激頻率為20 Hz和連續(xù)刺激，刺激持續(xù)時間30s或60 s。在體急性實(shí)驗(yàn)中藍(lán)光刺激采用20 Hz/30 ms的刺激參數(shù)，刺激時間為15 s;黃光刺激采用30 s的持續(xù)刺激。慢性實(shí)驗(yàn)中黃光刺激采用的參數(shù)為連續(xù)刺激60 s，每兩分鐘刺激一次，持續(xù)6h。記錄完后心臟灌流取出大腦組織，冠狀切片獲得腦片組織進(jìn)行位置鑒定以及免疫組織化學(xué)反應(yīng)。
　　結(jié)果:1、免疫組

10、化實(shí)驗(yàn)顯示在BF97.6±0.9％(n=4 mice)的ChR2-EYFP以及92.1±1.2％(n=5 mice)的Arch-GFP陽性神經(jīng)元是ChAT免疫組化陽性神經(jīng)元。2、離體腦片實(shí)驗(yàn)中，在ChAT-Arch小鼠的BF給予20 Hz/20 ms或者持續(xù)黃光刺激30s以及60 s都可以有效可逆的抑制膽堿能神經(jīng)元的放電。3、非活動期的ChAT-ChR2小鼠進(jìn)入SWS時，在BF給予15s的20 Hz/30 ms藍(lán)光刺激可以明顯引起小鼠由

11、SWS向清醒的轉(zhuǎn)化(66.1±6.2％)，而在野生型(WT)小鼠中SWS向清醒的轉(zhuǎn)化概率只有17.9±0.3％(P＜0.01，n=60 stimulations in3 mice)?；顒悠诖碳ひ鸬男?yīng)與非活動期類似。4、非活動期的ChAT-ChR2小鼠進(jìn)入SWS時，在BF給予15s的20 Hz/30 ms藍(lán)光刺激也可以顯著增加由SWS向REM睡眠的轉(zhuǎn)化(19.5±3.3％)，而在WT小鼠中SWS向REM睡眠的轉(zhuǎn)化概率只有2.9±2.9

12、％(P＜0.05，n=60 stimulations in3 mice)?；顒悠诖碳ひ鸬男?yīng)與非活動期類似。5、在非活動期， ChAT-Arch小鼠進(jìn)入SWS時，30 s的雙側(cè)黃光抑制BF膽堿神經(jīng)元明顯降低了動物由SWS向清醒的轉(zhuǎn)化概率（11.7±2.1％），而在對照組小鼠以及單側(cè)黃光抑制BF膽堿能神經(jīng)元的ChAT-Arch，其SWS向清醒的轉(zhuǎn)化概率分別為33.0±2.5％和27.5±3.1％(P＜0.01，n=60 stimulat

13、ions in3 mice)。在動物清醒時給予BF雙側(cè)黃光抑制，由清醒向SWS的轉(zhuǎn)化在抑制之后并沒有明顯的改變?；顒悠谝种埔鸬男?yīng)與非活動期類似。6、在非活動期，ChAT-Arch小鼠進(jìn)入SWS時，給予雙側(cè)黃光抑制可以延長單個SWS的持續(xù)時間，由73.5±5.3 s增加到105±10.5 s(P＜0.05，n=75 stimulations in3 mice)，在活動期抑制引起的效應(yīng)與非活動期類似。在非活動期或活動期，當(dāng)動物處于REM

14、睡眠時，給予雙側(cè)或單側(cè)黃光抑制并不影響單個REM睡眠的持續(xù)時間。7、在非活動期(13:00-19:00)和活動期(19:00-1:00)分別對ChAT-Arch小鼠的雙側(cè)BF膽堿能神經(jīng)元進(jìn)行6h的長時程黃光抑制，引起小鼠SWS的增加(P＜0.05，n=3 mice)，清醒時間的減少(P＜0.05，n=3 mice)，但不影響REM睡眠的時間。在6h長時程黃光抑制結(jié)束之后，清醒時間代償性增加以及SWS代償性減少。但是與抑制前相比較，抑制后