丙泊酚對發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的調(diào)控及其機制研究.pdf

1、研究背景:
　　每年都有數(shù)以百萬計的嬰幼兒在全身麻醉下安全實施外科手術(shù)或有創(chuàng)檢查。然而，越來越多可信的嚙齒類和靈長類的動物研究表明暴露于臨床常用的麻醉藥可對發(fā)育中的大腦產(chǎn)生神經(jīng)毒性，進而導(dǎo)致遠期的神經(jīng)認知功能障礙產(chǎn)生。臨床流行病學(xué)研究證實＜4歲兒童多次實施丙泊酚麻醉后認知功能障礙的發(fā)生率出現(xiàn)明顯增加。這些研究結(jié)果對目前安全使用于產(chǎn)科和兒科的全身麻醉藥丙泊酚提出嚴重質(zhì)疑。
　　全身麻醉藥根據(jù)使用方式可分為吸入麻醉藥及靜脈麻醉藥

2、，其主要通過改變NMDA和（或）GABA受體影響突觸傳遞進而產(chǎn)生麻醉效應(yīng)。既往在體動物實驗數(shù)據(jù)提示抑制NMDA受體、激活GABA受體可對發(fā)育期大腦產(chǎn)生毒副作用。丙泊酚作為激活GABA受體起效的最典型的靜脈全麻藥物，因其毒副作用小、麻醉誘導(dǎo)起效快、代謝快且體內(nèi)無蓄積等優(yōu)點，因而在臨床產(chǎn)科和兒科麻醉中廣泛使用。目前臨床上關(guān)于使用丙泊酚麻醉導(dǎo)致產(chǎn)生遠期學(xué)習(xí)記憶功能障礙的存在爭議，在體研究證實丙泊酚對發(fā)育中大腦的神經(jīng)元有促凋亡作用，反復(fù)多次應(yīng)用

3、丙泊酚可導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量增多，進而引起成年后學(xué)習(xí)記憶能力受損。但目前臨床和基礎(chǔ)研究顯示丙泊酚影響學(xué)習(xí)、記憶力的機制仍未明確，尤其是針對發(fā)育期大腦的功能形成及對遠期學(xué)習(xí)、記憶力影響的研究尚未深入開展。
　　海馬是參與認知、學(xué)習(xí)和記憶等腦高級功能的重要腦區(qū)，也是在生后哺乳動物包括人類都能觀察到存在神經(jīng)干細胞持續(xù)產(chǎn)生即神經(jīng)發(fā)生的主要腦區(qū)之一。研究表明海馬齒回顆粒下區(qū)神經(jīng)干細胞的神經(jīng)發(fā)生對腦功能發(fā)育和遠期行為關(guān)系密切。發(fā)育期海馬內(nèi)神經(jīng)

4、干細胞可通過自我增殖來維持不斷的神經(jīng)發(fā)生，同時干細胞的突起可以起到支架作用引導(dǎo)神經(jīng)元的遷移與成熟。調(diào)控發(fā)育期海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的因素將是調(diào)控其遠期功能形成的關(guān)鍵靶點。
　　研究表明麻醉藥神經(jīng)毒性引起的認知功能障礙與藥物暴露的時期密切相關(guān)，麻醉藥物所致的神經(jīng)元凋亡通常出現(xiàn)在出生后2周，在出生后7天時達高峰。既往研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚單次劑量注射與重復(fù)劑量注射均可導(dǎo)致發(fā)育期大腦神經(jīng)元凋亡及退化;最新的研究表明丙泊酚可以通過損害成年海馬新生神

5、經(jīng)元的存活與成熟調(diào)節(jié)海馬的神經(jīng)發(fā)生;此外丙泊酚可顯著減少月齡三個月大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元的分化，增加星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量;然而體外實驗證實丙泊酚臨床相關(guān)劑量可增加神經(jīng)干細胞向不同類型神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。由此看來，不同劑量的丙泊酚或者不同時期應(yīng)用丙泊酚對神經(jīng)系統(tǒng)的影響存在不同的效應(yīng)。因此，對于處在腦發(fā)育高峰期（出生后7天，即P7）的小鼠，丙泊酚對其海馬功能形成的影響仍有待考究;全麻藥丙泊酚是否通過調(diào)控海馬齒狀回干細胞進而影響機體認知功能目前尚不清楚

6、。闡明丙泊酚對發(fā)育機體海馬的神經(jīng)干細胞的影響及機制，將為臨床嬰幼兒期丙泊酚麻醉后出現(xiàn)認知功能障礙提供新機制，同時為臨床產(chǎn)科及兒科麻醉中合理用藥及相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的思路。
　　研究方法:
　　研究運用7日齡小鼠(P7)，單次腹腔注射丙泊酚30mg/kg(Prop(30mg/kg)）、60mg/kg(Prop(60mg/kg)）或者同體積的脂肪乳劑(Vehicle)建立模型。通過免疫組化檢測干細胞增殖特異性抗體標(biāo)記物B

7、rdu、Sox2及干細胞特異性抗體Nestin、BLBP在海馬齒狀回的表達，并進行比較分析，明確發(fā)育期丙泊酚暴露對海馬齒狀回中干細胞的影響。同時通過研究分析星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記物GFAP、小膠質(zhì)細胞Iba-1的改變評估早期丙泊酚暴露對海馬齒狀回中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的影響。此外，通過Western blot檢測海馬中Sox2蛋白的表達差異驗證發(fā)育期丙泊酚暴露對海馬齒狀回中干細胞增殖能力的影響，并通過檢測Akt，pAkt，Erk1/2，pErk1/2

8、海馬中蛋白表達差異探討丙泊酚暴露對早期海馬齒狀回干細胞的作用分子機制。
　　研究結(jié)果:
　　1.采用細胞增殖相關(guān)的特異性抗原標(biāo)記物Brdu與Sox2檢測丙泊酚對P7小鼠海馬齒狀回中干細胞增殖的影響。免疫組化結(jié)果顯示相對于Vehicle組，Prop(30mg/kg)組海馬齒狀回中Brdu(+)、Sox2(+)數(shù)量減少無統(tǒng)計學(xué)意義，而Prop(60mg/kg)組中Brdu(+)、Sox2(+)數(shù)量出現(xiàn)顯著性減少;不同劑量藥物組間

9、比較存在統(tǒng)計學(xué)差異，Prop(60mg/kg)組中Brdu(+)、Sox2(+)下降更明顯。
　　2.通過檢測早期神經(jīng)干細胞特異性抗體標(biāo)記物(Nestin、BLBP)比較丙泊酚處理發(fā)育小鼠后海馬齒狀回內(nèi)干細胞的特征變化，免疫熒光發(fā)現(xiàn)Prop(60mg/kg)組海馬內(nèi)神經(jīng)干細胞的數(shù)量下降且部分長突起受損，預(yù)示高劑量丙泊酚可損傷發(fā)育小鼠海馬神經(jīng)干細胞形態(tài)。
　　3.免疫熒光結(jié)果表明Prop(60mg/kg)組海馬齒狀回中標(biāo)記星形

10、膠質(zhì)細胞的GFAP數(shù)量較Vehicle組明顯減少，Prop(30mg/kg)組中GFAP數(shù)量無明顯改變;小膠質(zhì)細胞的特異性抗體Iba-1的免疫熒光結(jié)果顯示Prop(60mg/kg)與Prop(30mg/kg)組均顯著性降低海馬齒狀回中小膠質(zhì)細胞的數(shù)量。
　　4.Western blot結(jié)果表明:丙泊酚藥物處理組海馬中Sox2蛋白表達降低，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Vehicle組與Prop(60mg/kg)組及Prop(30mg/kg)組之間

11、Sox2蛋白表達均存在顯著性差異。
　　5.Western blot結(jié)果表明:丙泊酚處理組海馬中Akt及Erk表達水平無明顯改變，而pAkt及pErk表達水平下調(diào)，Prop(60mg/kg)組中下調(diào)更為顯著。統(tǒng)計學(xué)分析表明，Prop(30mg/kg)與Prop(60mg/kg)組較Vehicle組相比海馬中pAkt水平分別下降26％和49％，pErk表達水平分別下調(diào)43％和61％。
　　研究結(jié)論:
　　1.丙泊酚抑制發(fā)