人星形膠質細胞增強小鼠海馬齒狀回突觸的可塑性.pdf

1、星形膠質細胞(Astrocyte)是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目眾多的細胞之一,在神經(jīng)系統(tǒng)中不但起著支持、營養(yǎng)、保護的作用,而且還表現(xiàn)調節(jié)神經(jīng)元生長,神經(jīng)遞質傳遞,神經(jīng)元突觸電活動等諸多重要生物學功能。神經(jīng)膠質細胞功能的異常可以直接導致神經(jīng)系統(tǒng)功能的異常,許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病和損傷性疾病如阿爾茲海默病,帕金森綜合征,腦缺血后神經(jīng)功能損害程度等都與星形膠質細胞活化及功能活動異常有關。
　　 近年來,中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復一直是科研人員和

2、臨床工作者關注的重點。神經(jīng)干細胞移植已成為神經(jīng)退化性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷的一種嘗試性試驗治療手段。眾多行為學試驗表明移植神經(jīng)干細胞后,損傷的神經(jīng)系統(tǒng)功能有一定程度的改善,形態(tài)學研究結果表明移植的部分神經(jīng)干細胞可以在腦內發(fā)育成星形膠質細胞,其對神經(jīng)功能的改善可能發(fā)揮著一定的影響。但是由于神經(jīng)干細胞來源的復雜性,因此,對神經(jīng)干細胞種類、移植時間的選擇,對移植的細胞如何進行有效誘導使其分化為目的細胞及其修復機制的探討仍是此類研究的瓶頸。神經(jīng)

3、膠質細胞來自于神經(jīng)膠質祖細胞,神經(jīng)膠質祖細胞又由神經(jīng)干細胞分化而來。目前關于神經(jīng)膠質祖細胞對神經(jīng)系統(tǒng)結構和功能重建作用的相關報道仍不充分星形膠質細胞可以通過釋放ATP,D-絲氨酸,腫瘤壞死因子等生物活性物質來調節(jié)突觸的數(shù)量,突觸的反應強度及突觸間神經(jīng)遞質的傳遞?；谝陨闲畔?我們感興趣的是:經(jīng)細胞移植后分化存活的星形膠質細胞是否會影響突觸的功能及其可能的機制。
　　 本課題利用將人神經(jīng)膠質祖細胞移植到正常小鼠腦內兩側側腦室周區(qū)的

4、動物模型,應用多種實驗方法觀察分化的人星形膠質細胞的形態(tài)特點,觀察人星形膠質細胞的生理學特性,觀察人星形膠質細胞對小鼠海馬齒狀回突觸活動的影響。為探討星形膠質細胞的結構發(fā)育與功能特點提供體內實驗依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 一、主要試劑：來自于17—22周的流產(chǎn)人胚的前腦腦室下區(qū)的神經(jīng)膠質祖細胞(A2B5細胞)和CMV-綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,EGFP)逆轉錄病毒由美國羅切

5、斯特大學的Goldman教授惠贈；小鼠抗人核單克隆抗體,小鼠抗人NG2單克隆抗體,兔抗A2B5多克隆抗體(Chemicon,美國),小鼠抗人神經(jīng)膠質酸性蛋白Hgfap單克隆抗體(Sternberger公司,美國),小鼠抗人線粒體單克隆抗體(USBiological公司,美國),兔抗D-絲氨酸多克隆抗體,雞抗層粘連蛋白多克隆抗體(Abcam公司,美國),小鼠抗NMDARI單克隆抗體,(Sternberger公司,美國),羊抗人腫瘤壞死因子

6、多克隆抗體(R&D systems,美國),羊抗絲氨酸消旋酶多克隆抗體(Santa Cruz,美國),DAPI核DAPI核染色劑和Cy3或Cy5熒光標記的二抗(Jackson公司,美國)
　　 二、主要儀器：細胞培養(yǎng)箱和超凈臺(Erlab,美國)；共聚焦顯微鏡和Fluview300圖像分析系統(tǒng)((Olympus,日本)；熒光倒置顯微鏡(Olympus,日本)；恒溫冷凍切片機(Leiea,德國)；-80℃深低溫冰箱(Toshiba

7、,日本)；立體定位微注射儀(USEquipment Co,美國)；雙光子激光顯微鏡(Olympus,日本)；紫外線激光發(fā)生器(US Equipment Co,美國)；電生理描記系統(tǒng)(US Equipment Co,美國)；震蕩切片機(Leica,德國)；行為學實驗記錄箱(Coulboum Instruments,美國)。
　　 三、實驗方法：
　　 1、實驗動物：實驗動物為新生24h以內的Rag2小鼠60只,雌雄不限,購

8、自美國Jackson實殮室。隨機分為兩組:實驗組和對照組。
　　 2、神經(jīng)膠質祖細胞的培養(yǎng)和轉染：A285細胞用DMEM/F12/N1無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),其內加入20ng/ml Bfgf。轉染按文獻的方法進行,將細胞與CMV-EGFP逆轉錄病毒孵育過夜,棄上清,用DMEM/F12/N1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3-5天。用熒光倒置顯微鏡觀察,轉染成功的A285細胞(表達綠色熒光蛋白)用于移植實驗。
　　 3、神經(jīng)膠質祖細胞的移植:轉染

9、后的A285細胞用胰蛋白酶消化,吹打細胞懸浮于HBSS中。將出生24h內的Rag2小鼠冰上麻醉后,固定于立體定位儀上,用玻璃微量加樣器將1ul(1×105/ul)的細胞懸液平均注入兩側側腦室周區(qū)。
　　 4、免疫組織化學:染色觀察細胞形態(tài)結構。
　　 5、膜片鉗方法記錄膠質細胞電生理特性：將400微米厚的腦片置于雙光子激光顯微鏡下,用膜片鉗方法記錄人神經(jīng)膠質細胞的形態(tài),膜電位,細胞阻抗等生理指標。用膜片鉗方法向細胞內注入

10、鈣指示劑(rhod2)與鈣蝥合劑(NP-EGTA),用紫外激光激發(fā)鈣釋放,雙光子顯微鏡下觀察鈣波傳導,測量鈣波傳導速度[42]。
　　 6、電生理LTP實驗：選取含海馬齒狀回的腦片進行記錄興奮性突觸后電位和長時程增強效應實驗。在海馬齒狀回的顆粒下區(qū)(苔蘚纖維)放置記錄電極和刺激電極。
　　 7、TNFa抑制劑給藥方法：小鼠在進行電生理實驗前10天起,每天給予Thalidomide腹腔注射(500mg/kg,I.p,0.2

11、5-0.3 ml)。
　　 8、行為學實驗：關于學習和記憶的行為學實驗在兩個記錄箱中進行。第一個記錄箱用于訓練動物,第二個記錄箱用于檢測和錄像記錄。小鼠在箱內適應3分鐘后,給予長達30秒420HZ的聲音刺激,在聲音刺激結束后,給予2秒鐘0.3mA的電流刺激足部。實驗結果用Freezeview software軟件進行分析9、統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用mean±SD表示,用Sigma stat8.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,差異顯著

12、性采用t檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結果：
　　 1、細胞培養(yǎng)觀察神經(jīng)膠質祖細胞的轉染細胞成功表達綠色熒光蛋白。轉染并培養(yǎng)5天后,細胞分化為扁平梭形多突起的細胞,A2B5免疫熒光染色為陽性。
　　 2、神經(jīng)膠質祖細胞的分布移植6個月后,可見分化的神經(jīng)膠質祖細胞主要分布于皮層,胼胝體,海馬和側腦室周圍,細胞表達綠色熒光蛋白。
　　 3、神經(jīng)膠質祖細胞的分化和細胞結構特點免疫熒光染色結果表明,移

13、植后的細胞主要分化成星形膠質細胞,并體現(xiàn)人星形膠質細胞的結構特點:細胞大,突起多,突起長,線立體沿細胞長突起排列,突起末端與血管接觸。海馬中可見Hng2表達陽性的細胞。
　　 4、人星形膠質細胞的生理學特性與鼠星形膠質細胞相比,人星形膠質細胞細胞阻抗略高,靜息膜電位無統(tǒng)計學差別。紫外激光激發(fā)實驗顯示鈣波可沿人星形膠質細胞的長突起傳遞,人星形膠質細胞鈣波傳導速度比鼠星形膠質細胞快。
　　 5、Fepsp和LTP實驗在不同的

14、強度刺激下,實驗組的Fepsp明顯高于對照組。LTP實驗結果顯示HFS后,實驗組的Fepsp反應可持續(xù)60分鐘,而對照組回到基線。兩者的差別有統(tǒng)計學意義。
　　 6、免疫染色分析TNFa和GluRl的表達實驗組的TNFa和Glugl的表達均高于對照組,而NRl的表達在兩者并無明顯區(qū)別。注射Thalidomide后,實驗組TNFa和GluRl的表達均低于對照組,NRl的表達在兩者并無明顯區(qū)別。
　　 7、行為學實驗分析學習

15、記憶能力的差異實驗組的小鼠學習和記憶的能力明顯高于對照組。
　　 結論：
　　 1、將人神經(jīng)膠質祖細胞移植入正常小鼠腦內兩側側腦室周區(qū)后,細胞在移植部位存活、分化、增殖并體現(xiàn)人星形膠質細胞的形態(tài)結構特點。
　　 2、分化的人星形膠質細胞可能參與了宿主腦內血腦屏障的形成。
　　 3、分化的人星形膠質細胞表達人細胞的電生理學特性,鈣波傳導速度比鼠星形膠質細胞快。
　　 4、人星形膠質細胞加強了小鼠海馬