助陽(yáng)寧神方拮抗應(yīng)激致抑郁小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性損傷的作用研究.pdf

1、研究目的
　　 依據(jù)中醫(yī)臨床“助陽(yáng)入腦，降火寧神”的治療抑郁癥的新思想創(chuàng)制助陽(yáng)寧神方，該方在臨床上確具較好療效。研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能不是通過(guò)影響單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)而產(chǎn)生，而可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性改變有關(guān)。為此，本課題采用皮質(zhì)酮注射制備抑郁動(dòng)物模型，從非單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性入手，觀察應(yīng)激和助陽(yáng)寧神方(Zhuyang-ningshen Formula，ZNF)作用前后星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性變化：包括GFAP蛋白的表達(dá)

2、改變、星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量等，期望探究助陽(yáng)寧神方在該模型的效應(yīng)，闡明調(diào)節(jié)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性是助陽(yáng)寧神方臨床改善抑郁癥的作用機(jī)制，從而使“助陽(yáng)入腦，降火寧神”思想得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，為抑郁癥防治和新藥研發(fā)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　 研究方法
　　 (1)助陽(yáng)寧神方藥效學(xué)研究
　　 采用利血平拮抗模型觀察小鼠閉眼率；5-羥色氨酸（5-hydroxytryptophane,5-HTP）誘導(dǎo)的甩頭行為模型觀測(cè)甩頭率及

3、甩頭次數(shù)；育亨賓毒性模型觀測(cè)各組小鼠死亡率；懸尾實(shí)驗(yàn)觀測(cè)行為學(xué)改變。
　　 (2)抑郁小鼠模型制備及助陽(yáng)寧神方抗抑郁有效性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究
　　 皮質(zhì)酮皮下注射制備抑郁動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)分為6組，分別是正常組、模型組、氟西汀組，助陽(yáng)寧神方低劑量組(1.9g/kg)、中劑量組(3.8g/kg)和高劑量組(7.6g/kg)，每組8只，共48只C57BL/6N小鼠；采用強(qiáng)迫游泳、強(qiáng)迫懸尾觀察給藥4周后小鼠行為學(xué)改變和體重變化，然后處死

4、動(dòng)物，快速取腦剝離海馬，Western blot蛋白免疫印跡檢測(cè)神經(jīng)元NF-L、SY-P蛋白表達(dá)變化，同時(shí)，觀測(cè)助陽(yáng)寧神方對(duì)該模型的拮抗作用。
　　 (3)基于星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的助陽(yáng)寧神方抗抑郁作用機(jī)制研究
　　 實(shí)驗(yàn)分6組，分別是正常組、模型組、氟西汀組，助陽(yáng)寧神方低劑量組(1.9g/kg)、中劑量組(3.8g/kg)和高劑量組(7.6g/kg)，每組12只C57BL/6N小鼠，共72只小鼠。給藥4周后，采用West

5、ern blot及免疫組化技術(shù)觀測(cè)海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、BDNF和GDNF表達(dá)改變，體視學(xué)分析技術(shù)檢測(cè)海馬GFAP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　 研究結(jié)果
　　 (1)助陽(yáng)寧神方藥效學(xué)研究結(jié)果
　　 1)利血平拮抗模型
　　 與模型組閉眼率100％比，氟西汀組閉眼率為30%，閉眼率顯著降低(P＜0.01)，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組閉眼率依次為60%、50%、40%，閉眼率也顯著性降低(P＜0.05、

6、P＜0.05、P＜0.01)，與氟西汀組比，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組閉眼率隨劑量下降，閉眼率逐漸下降，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2)5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為模型
　　 連續(xù)給藥第3天、第7天15min后，正常組、氟西汀組、助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組甩頭率分別為：40%、80%、50%、40%和30%;40%、90%、40%、30%和20%，與正常組比，氟西汀組甩頭率明顯增加(P＜0.01)，而ZNF高、中

7、、低劑量組均未增加甩頭率（P均＞0.05）；與氟西汀組比，ZNF高、中、低劑量組均甩頭率顯著下降(P＜0.01)；第7天15min后，各相應(yīng)組甩頭次數(shù)依次為70次、246次、53次、27次和34次；ZNF各組甩頭次數(shù)與正常組比無(wú)顯著上升（P均＞0.05）。
　　 3)育亨賓毒性模型
　　 正常組、氟西汀組、ZNF高、中、低劑量組死亡小鼠依次為1只、5只、2只、1只、1只，與正常組比，氟西汀組小鼠死亡率顯著升高(P＜0.0

8、1)，而ZNF各組小鼠死亡率未顯著上升(P＞0.05)，與氟西汀組比，ZNF各組小鼠死亡率顯著下降（P均＜0.01）。
　　 4)懸尾實(shí)驗(yàn)
　　 與正常組比，氟西汀組、ZNF高、中、低劑量組懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著縮短(p＜0.01或p＜0.05)。
　　 (2)皮質(zhì)酮致抑郁小鼠模型建立及助陽(yáng)寧神方有效性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1)體重變化結(jié)果
　　 各實(shí)驗(yàn)組起始體重?zé)o顯著性差異（P均＞0.05）,4周后，模

9、型組動(dòng)物較正常組動(dòng)物體重明顯減輕(P＜0.05)，但其他各組與模型組比，均具有上調(diào)體重趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。
　　 2)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果
　　 在懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳中，與正常組比，模型組不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.01，P＜0.05)，與模型組比，氟西汀組不動(dòng)時(shí)間明顯縮短(P＜0.01，P＜0.05)，助陽(yáng)寧神方中((P＜0．01，P＜0.05)、低劑量組（P均＜0.05）不動(dòng)時(shí)間也顯著縮短，助陽(yáng)寧神方

10、高劑量組不動(dòng)時(shí)間未見(jiàn)顯著縮短(P＞0.05)。
　　 3)western blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 與正常組比，模型組NF-L、SYP表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01、P＜0.05)；與模型組比，氟西汀組NF-L、SYP表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01、P＜0.05)，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組均能明顯上調(diào)NF-L、SYP表達(dá)水平（P均＜0.05）。
　　 (3)基于星形膠質(zhì)細(xì)胞可塑性的助陽(yáng)寧神方抗抑郁作用機(jī)制

11、研究結(jié)果
　　 1)western blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 與正常組比，模型組GFAP、BDNF及GDNF的表達(dá)較正常組水平顯著下調(diào)(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01),與模型組比，氟西汀組除GDNF未見(jiàn)顯著上調(diào)外，其他指標(biāo)均顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，助陽(yáng)寧神方中、低劑量組均能顯著上調(diào)GFAP、BDNF及GDNF的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05或P＜0.01)，而ZNF高劑量組顯著上調(diào)GFAP及

12、GDNF(P＜0.05或P＜0.01)，而對(duì)BDNF卻無(wú)顯著上調(diào)作用(P＞0.05)。
　　 2)免疫組化表達(dá)結(jié)果
　　 在海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)，與正常組比，模型組GFAP陽(yáng)性區(qū)域總光密度值和面積均明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，與模型組比，氟西汀組、助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組均能顯著上調(diào)GFAP陽(yáng)性區(qū)域總光密度值（P＜0.05或P＜0.01）；在CA3區(qū)助陽(yáng)寧神方高、中劑量組及在CA1區(qū)助陽(yáng)寧神方中劑量組GF

13、AP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域面積明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0．01)；在DG區(qū)，氟西汀組、助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組GFAP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域總光密度值顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，但GFAP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域面積均無(wú)明顯上調(diào)(P＞0．05)。
　　 3)體視學(xué)分析結(jié)果
　　 與正常組比，模型組海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞）個(gè)數(shù)顯著下調(diào)(P＜0.05)，與模型組比，氟西汀組、ZNF高、中劑量組能顯著上調(diào)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(P＜0