抗抑郁藥物的神經(jīng)可塑性促進(jìn)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:抑郁癥是一種慢性易復(fù)發(fā)的疾病，世界上約五分之一的人口受到抑郁癥的困擾。抑郁癥的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，大量文獻(xiàn)報道抑郁癥與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)子和神經(jīng)可塑性之間存在一定的聯(lián)系，然而，其具體的關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)的研究。單次注射氯胺酮可以在30min內(nèi)起到抗抑郁效果，并且可以持續(xù)1個星期，雖證實(shí)可能與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)可塑性相關(guān)，但氯胺酮的速效及長效的機(jī)制尚不清楚。進(jìn)一步闡明抑郁癥與BDNF和神經(jīng)可塑性的系統(tǒng)關(guān)系，研究氯胺酮在治療抑

2、郁時的速效和長效與BDNF和神經(jīng)可塑性的具體關(guān)系和作用機(jī)制，有利于進(jìn)一步深入了解抑郁癥的病理生理學(xué)機(jī)制，為抗抑郁藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。常春藤皂苷元具有一定的抗抑郁生物活性，然而，其活性不強(qiáng)，對其結(jié)構(gòu)改造以提升其抗抑郁活性的研究較少。
　　 本研究旨在檢測在抑郁的發(fā)病和治療過程中，BDNF和神經(jīng)可塑性的作用;研究糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮對氯胺酮在BDNF表達(dá)中的促進(jìn)作用的影響，并探討氯胺酮的速效和長效機(jī)制與神經(jīng)可塑性及BDNF的關(guān)系;研

3、究氯胺酮增強(qiáng)小鼠海馬神經(jīng)元神經(jīng)可塑性可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;對具有抗抑郁活性的常春藤皂苷元進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，并檢測其抗抑郁效果及機(jī)制。
　　 方法:1.以C57BL/6小鼠作為研究對象，采用長期皮質(zhì)酮暴露的方法造成焦慮/抑郁模型，經(jīng)過30d的飲水給藥（皮質(zhì)酮，35 mg·L-1）以后，通過高架迷宮實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)，檢測小鼠的行為學(xué)變化。當(dāng)確認(rèn)小鼠已經(jīng)達(dá)到焦慮/抑郁樣狀態(tài)以后，進(jìn)入治療、康復(fù)階段，每天腹腔注射氟西汀(18 mg·kg-1)。

4、20 d以后，檢測小鼠的行為學(xué)變化。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，分別在第10d，20 d，35 d，45 d，60 d取材，進(jìn)行高爾基染色和免疫熒光染色。計數(shù)海馬CA1，CA3區(qū)椎體神經(jīng)元樹突棘密度的變化和DG區(qū)顆粒神經(jīng)元樹突棘密度的變化，檢測海馬CA1區(qū)，CA3區(qū)和DG區(qū)（包括新生神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元）神經(jīng)元內(nèi)BDNF的表達(dá)變化。
　　 2.以C57BL/6小鼠為研究對象，研究單次注射氯胺酮（3.0 mg·kg-1）對小鼠BDNF的表達(dá)和

5、神經(jīng)可塑性的影響。采用長期皮質(zhì)酮暴露(飲水中給予皮質(zhì)酮35mg·L-1)造成焦慮/抑郁模型，單次給予腹腔注射氯胺酮以后，使用Western blotting法檢測氯胺酮對BDNF的促進(jìn)作用在抑郁鼠和正常鼠的不同，并運(yùn)用糖皮質(zhì)激素受體抑制劑RU486進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。在此基礎(chǔ)上，一方面研究短期給予皮質(zhì)酮對氯胺酮在BDNF表達(dá)中的促進(jìn)作用中的影響，并探討氯胺酮的速效(30 min)和長效(7 d)的病理生理學(xué)基礎(chǔ):采用皮質(zhì)酮暴露的方法，給皮質(zhì)

6、酮3天以后，單次腹腔注射氯胺酮（3.0 mg·kg-1）后分別在第30min和第7d取材，檢測BDNF的表達(dá)和突觸素(Synaptophysin)的變化。一方面研究氯胺酮提高小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性的機(jī)制:以C57BL/6小鼠為研究對象，在單次給予氯胺酮后的15min，45 min，4h和24 h時間點(diǎn)取材，應(yīng)用Western blotting法檢測Rac1信號通路中的Rac1GTPase，Tiam1，RacGAP1，和P-cofili

7、n的變化情況，擬探討氯胺酮提高小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性與Rac1信號通路的關(guān)系。
　　 3.設(shè)計并合成常春藤皂苷元酰胺衍生物N-（3-二甲氨基丙基）-常春藤皂苷元-17-甲酰胺(HGA)。以常春藤皂苷元為原料，經(jīng)DCC/NHS將常春藤皂苷元28位的羧基活化，加入二甲氨基丙胺反應(yīng)得HGA。經(jīng)質(zhì)譜，核磁氫譜和碳譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。然后，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測其純度。在此基礎(chǔ)上，在細(xì)胞水平，以原代海馬神經(jīng)元為研究對象，用皮質(zhì)酮

8、（10μmol·L-1）損傷造模，探討HGA對原代海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用;在整體動物水平，應(yīng)用急性給藥的方法，研究HGA急性給藥對C57BL/6小鼠行為學(xué)的影響。并且，從BDNF和神經(jīng)可塑性的角度研究其抗抑郁作用的機(jī)制。
　　 結(jié)果:1.神經(jīng)可塑性和BDNF在抑郁癥發(fā)病及治療中的變化
　　 (1)慢性皮質(zhì)酮暴露及長期的氟西汀治療對小鼠行為學(xué)的影響
　　 給予皮質(zhì)酮暴露30 d以后，高架迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠進(jìn)入開臂

9、的次數(shù)著減少（t=2.202，P=0.043），懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠的不動時間顯著延長（t=2.094，P=0.047）;經(jīng)過20 d的氟西汀治療以后，小鼠在高架迷宮實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入開臂的次數(shù)顯著增多(P=0.007)，懸尾實(shí)驗(yàn)中小鼠的不動時間顯著(P=0.000)減少。
　　 (2)慢性皮質(zhì)酮暴露及長期氟西汀治療對小鼠神經(jīng)可塑性的影響
　　 與相應(yīng)的對照組相比，10d和20 d的皮質(zhì)酮處理對海馬各區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度沒有產(chǎn)生顯

10、著的影響，經(jīng)過35 d的皮質(zhì)酮的處理以后，與相應(yīng)的溶劑對照組(VEH)的神經(jīng)元的樹突棘的密度相比，CA1區(qū)(t=2.626，P=0.030)和CA3區(qū)(t=2.982，P=0.018)神經(jīng)元樹突棘的密度顯著降低。
　　 經(jīng)過45 d的皮質(zhì)酮處理以后的，海馬的所有亞區(qū)的神經(jīng)元樹突棘的密度均明顯少于相應(yīng)的溶劑對照組的神經(jīng)元樹突棘的密度（CA1: P=0.004; CA3:P=0.000; DG: P=0.002）。經(jīng)過60 d的皮質(zhì)

11、酮處理以后海馬各區(qū)神經(jīng)元樹突棘的密度均明顯的少于相應(yīng)的溶劑對照組的樹突棘的密度(CA1: P=0.001;CA3:P=0.000; DG: P=0.004)。
　　 經(jīng)過10 d的氟西汀處理以后，與相應(yīng)的CORT組相比，經(jīng)氟西汀處理的CORT+FLX組的CA1區(qū)(P=0.000)和CA3區(qū)(P=0.004)的神經(jīng)元樹突棘的密度顯著提高。經(jīng)過25 d的氟西汀處理以后，與相應(yīng)的CORT組相比，CORT+FLX組的海馬所有亞區(qū)的神經(jīng)元

12、樹突棘的密度均顯著升高(CA1: P=0.000; CA3:P=0.000; DG: P=0.010)。
　　 (3)慢性皮質(zhì)酮暴露及長期氟西汀治療對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞體內(nèi)BDNF水平的影響
　　 經(jīng)過10 d的皮質(zhì)酮處理后，與相應(yīng)的對照組相比，DG區(qū)的新生神經(jīng)元（t=4.416，P=0.002）與成熟神經(jīng)元（t=3.371，P=0.010）胞體中的BDNF的水平顯著升高。經(jīng)過20 d的皮質(zhì)酮處理后，與相應(yīng)的對照組相比，

13、DG區(qū)成熟神經(jīng)元（t=3.848，P=0.005），DG區(qū)新生神經(jīng)元（t=3.991，P=0.004）和CA3(t=3.495，P=0.008)區(qū)神經(jīng)元胞體中的BDNF的水平顯著升高。經(jīng)過35 d的皮質(zhì)酮處理后，與相應(yīng)的對照組相比，DG區(qū)成熟神經(jīng)元(t=2.501，P=0.037)，CA3區(qū)（t=3.670，P=0.006），CA1區(qū)（t=3.549，P=0.008）神經(jīng)元中的BDNF水平顯著提高。
　　 與相應(yīng)的VEH組相比，

14、45天的皮質(zhì)酮處理后，CA1區(qū)神經(jīng)元(P=0.001)和DG區(qū)新生神經(jīng)元(P=0.001)的BDNF的水平顯著減少。經(jīng)過60 d的皮質(zhì)酮處理后，與相應(yīng)的VEH組相比，海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元和DG區(qū)新生神經(jīng)元中的BDNF的水平均顯著升高(CA1: P=0.031;CA3: P=0.008; DG-N:P=0.012)。
　　 經(jīng)過10 d(36 d-45 d)的氟西汀處理后，與相應(yīng)的CORT組相比，DG區(qū)成熟神經(jīng)元(P=0.

15、000)和新生神經(jīng)元(P=0.003)胞體內(nèi)的BDNF的水平顯著減少。與相應(yīng)的各CORT組相比，經(jīng)過25 d的氟西汀處理后，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元、DG區(qū)成熟神經(jīng)元和新生神經(jīng)元中的BDNF的水平均顯著降低（CA3: P=0.025;DG-M: P=0.001;DG-N: P=0.001）。
　　 2.氯胺酮抗抑郁作用與神經(jīng)可塑性和BDNF的關(guān)系及其機(jī)制研究
　　 (1)氯胺酮對BDNF的促進(jìn)作用及糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮的影響

16、>　　 與給予單次氯胺酮注射的正常鼠相比，給抑郁鼠單次注射氯胺酮，給藥后30min時，抑郁鼠海馬BDNF的表達(dá)顯著升高(F=12.493，P=0.008)，并且糖皮質(zhì)激素受體抑制劑Ru486可以顯著抑制這種升高(F=15.499，P=0.004)。但是短期(3 d)的皮質(zhì)酮處理卻不能達(dá)到相似的效果，氯胺酮可顯著促進(jìn)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)(F=927.149，P=0.000);短期(3 d)的糖皮質(zhì)激素受體抑制劑處理不會對氯胺酮的BDNF

17、促進(jìn)作用產(chǎn)生影響(F=0.165，P=0.690)。單劑量給予氯胺酮以后30 min時，小鼠海馬突觸素(Synaptophysin)表達(dá)水平較對照組沒有發(fā)生顯著變化(F=0.897，P=0.358)。糖皮質(zhì)激素受體抑制劑Ru486對突觸素的表達(dá)也沒有顯著影響(F=1.524，P=0.235)。單劑量給予氯胺酮以后7d時，與對照組相比，小鼠海馬BDNF水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著改變(F=1.539，P=0.233)。并且短期的糖皮質(zhì)激素受體抑制劑R

18、u486處理也沒有對氯胺酮的BDNF促進(jìn)作用產(chǎn)生顯著影響(F=2.275，P=0.151)。單劑量給予氯胺酮以后7d時，給予了氯胺酮的各組小鼠海馬突觸素(Synaptophysin)表達(dá)水平顯著提高(F=466.104，P=0.000)。并且短期的Ru486處理(3 d)不影響突觸素的表達(dá)(F=4.308，P=0.054)。
　　 (2)氯胺酮對Rac1信號通路的影響
　　 與對照組相比，在給予單劑量氯胺酮后，Rac1-

19、GTPase在15min（t=4.023，P=0.016）和45 min（t=3.939，P=0.017）兩個時間點(diǎn)均顯示升高，在給藥后的4h時，恢復(fù)到正常水平（t=0.570，P=0.599）;在給予單劑量氯胺酮后15 min時間點(diǎn)，與對照組相比，Tiam1水平顯著升高(F=953.626，P=0.000)，并且在給予單劑量氯胺酮后45 min時，Tiam1仍顯著升高(F=70.369，P=0.000)，在單劑量注射氯胺酮以后4h時間

20、點(diǎn)Tiam1的表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平(F=1.259，P=0.278);在給予單劑量氯胺酮后15min時，與對照組相比，RacGAP1表達(dá)水平顯著降低(F=20.750，P=0.000)，并且持續(xù)到給予單劑量氯胺酮后45 min時間點(diǎn)，RacGAP1仍顯著降低(F=181.808，P=0.000)。給予單劑量氯胺酮以后4h時間點(diǎn)，RacGAP1的表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平(F=0.343，P=0.566);在給予單劑量氯胺酮的15 min，與對照組

21、相比，Cofilin的磷酸化水平顯著升高(F=617.735，P=0.000);單劑量給予氯胺酮后的45m in(F=259.295，P=0.000)和4h（F=148.986，P=0.000），Cofilin的磷酸化水平均持續(xù)顯著升高。在單劑量給予氯胺酮后的24 h的時間點(diǎn)，Cofilin的磷酸化水平回到基礎(chǔ)水平（F=2.453，P=0.137）。
　　 3.常春藤皂苷元結(jié)構(gòu)改造與生物活性及其機(jī)制研究
　　 (1)通過

22、普通化學(xué)合成的方法，經(jīng)柱色譜分離，得到了白色粉末狀化合物N-（3-二甲氨基丙基）-常春藤皂苷元-17-甲酰胺(HGA)。質(zhì)譜圖顯示分子離子峰是558.0([M+H]+)而HGA的相對分子質(zhì)量為556.86;核磁氫譜的數(shù)據(jù):1H-NMR(CD30D):δ5.26(t,J=3.4 Hz,1H,C=C-H),3.99(dd,J1=14Hz，J2=7.2Hz,1H),3.48-3.52(m,1H),3.41(d,J=10.8,1H),3.05-

23、3.11(m,1H),2.91(t,J=7.2 Hz,2H),2.71(s,6H, NMe2),1.91(s,1H),1.05-1.43(m,22H),0.78-0.95(m,18H)，0.686(3H，s，CH3)，0.596(3H，s，CH3)，與HGA的結(jié)構(gòu)相吻合;核磁碳譜數(shù)據(jù):δ180.02(C=O),143.67(C=C),122.65(C=C),72.30,65.76,60.07,55.38,46.20,46.10,42.2

24、2,41.82,41.51,40.99,39.20,37.97,36.43,35.90,33.58,33.20,33.02,31.81,30.14,27.06,25.93,25.03,24.87,23.06,22.57,22.44,19.38,17.62,16.56,14.78，12.98，11.24，與HGA的結(jié)構(gòu)相吻合。綜合以上的分析，合成所得化合物為目標(biāo)化合物HGA。利用高效液相色譜（HPLC），以甲醇-水-冰醋酸-乙二胺(87∶

25、13∶0.04∶0.02)為流動相，210nm為檢測波長，發(fā)現(xiàn)，HGA出峰時間為59.09 min，歸一化法的計算結(jié)果顯示HGA的純度為94.08％(HPLC)。
　　 (2)常春藤皂苷元酰胺衍生物HGA的抗抑郁生物活性及機(jī)制研究
　　 HGA神經(jīng)保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，MTT結(jié)果顯示，化合物HGA可以在0.1μmol·L-1(P=-0.042)。而相同實(shí)驗(yàn)條件下1μmol·L-1的HG(P=0.866)不能對神經(jīng)元產(chǎn)生顯著的保

26、護(hù)作用。急性給藥的小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，HGA在10 mg·kg-1時可以顯著(P=0.010)縮短C57BL/6小鼠的不動時間。在此基礎(chǔ)上，從BDNF和神經(jīng)可塑性的角度對其機(jī)制進(jìn)行研究，Western blotting的結(jié)果顯示，HGA可以顯著逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮所導(dǎo)致的BDNF(P=0.000)和突觸素（Synaptophysin，P=0.000）蛋白的表達(dá)水平的下降。
　　 結(jié)論:1.在抑郁的發(fā)生發(fā)展過程中BDNF的表達(dá)水平先升高

27、，再降低，最后又升高，呈波浪形變化。并且在給予氟西汀治療以后，BDNF的表達(dá)水平與抑郁但未接受治療的小鼠相比，顯著下降，說明BDNF與小鼠的抑郁狀態(tài)密切相關(guān)，但關(guān)系復(fù)雜。在抑郁的發(fā)生階段，BDNF應(yīng)激性的升高可能對神經(jīng)可塑性起到一定的保護(hù)作用。海馬神經(jīng)元樹突棘密度則隨著小鼠的抑郁狀態(tài)的發(fā)生、發(fā)展而不斷降低，當(dāng)給與氟西汀治療以后，小鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度迅速升高而且與小鼠的行為學(xué)狀態(tài)呈正相關(guān)，說明神經(jīng)可塑性的變化很可能是抑郁的病理生理學(xué)基

28、礎(chǔ)。
　　 2.氯胺酮在抑郁鼠身上對BDNF表達(dá)的促進(jìn)作用更加顯著，而這種顯著的促進(jìn)作用可以被糖皮質(zhì)激素受體抑制劑Ru486所阻斷。但短期(3 d)的皮質(zhì)酮處理不能顯著影響氯胺酮對BDNF的促進(jìn)作用。單劑量注射氯胺酮的速效抗抑郁作用可能與促進(jìn)BDNF的表達(dá)相關(guān)，其長效可能與其改善了神經(jīng)可塑性有關(guān)。單劑量氯胺酮可能是通過激活Rac1信號通路，促進(jìn)Cofilin的磷酸化，抑制Cofilin的剪切作用，最終改善神經(jīng)可塑性，起到長效的抗