nNOS調(diào)控成年海馬齒狀回神經(jīng)元再生及其分子機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)神經(jīng)科學(xué)研究的一項(xiàng)重要進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)某些特定區(qū)域在正常狀態(tài)下存在著進(jìn)行性的神經(jīng)元再生。在某些生理刺激和病理狀態(tài)下，這些部位的神經(jīng)發(fā)生表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)現(xiàn)象。這意味著通過(guò)調(diào)控某些缺血相關(guān)的分子可激活內(nèi)源性神經(jīng)元再生機(jī)制，促進(jìn)腦損傷修復(fù)。顯然，闡明腦缺血激發(fā)神經(jīng)元再生的分子調(diào)控機(jī)制，將更新中風(fēng)及其它神經(jīng)退化性疾病的治療策略、明晰正確的藥物干預(yù)環(huán)節(jié)和發(fā)現(xiàn)新藥靶。然而，目前關(guān)于成年腦神經(jīng)元再生的研究主要重于發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象，而決定這些現(xiàn)

2、象的本質(zhì)問(wèn)題所知甚少。 NO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種新型信號(hào)分子在成年腦神經(jīng)元再生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，NO以及合成NO的NOS對(duì)神經(jīng)元再生調(diào)控的研究目前已成為熱點(diǎn)問(wèn)題。然而目前關(guān)于NO/NOS對(duì)神經(jīng)元再生的調(diào)控的研究卻一直存在著矛盾的結(jié)果。新近有報(bào)道指出，nNOS源性的NO在生理狀態(tài)下抑制了成年動(dòng)物SVZ區(qū)的神經(jīng)元再生。然而，其對(duì)海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生目前為止還存在著爭(zhēng)議。此外，我們?cè)缙诘难芯拷Y(jié)果表明，局灶性腦缺血后iNOS表達(dá)

3、增加激發(fā)了海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生。既然nNOS和iNOS的催化產(chǎn)物都是NO，那么nNOS在腦缺血后的表達(dá)有何變化，其對(duì)缺血后DG神經(jīng)元再生有無(wú)影響，這些問(wèn)題目前尚無(wú)明確報(bào)導(dǎo)，有待進(jìn)一步確證。 因此，本論文旨在探討nNOS在生理狀態(tài)下以及腦缺血后對(duì)成年海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生的調(diào)控作用，并初步探討其對(duì)神經(jīng)元再生的分子調(diào)控機(jī)制。闡明這一問(wèn)題，將從一個(gè)側(cè)面揭示腦缺血激發(fā)神經(jīng)元再生的細(xì)胞和分子調(diào)控機(jī)制，從而為腦缺血疾病的治療開辟新的路徑。

4、 第一章：生理狀態(tài)下nNOS抑制成年海馬齒狀回神經(jīng)元再生 目的：通過(guò)藥理學(xué)方法抑制nNOS活性，觀察生理狀態(tài)下nNOS活性被抑制后對(duì)成年海馬齒狀回(dentategyrus，DG)神經(jīng)元再生的影響。并對(duì)生理狀態(tài)下nNOS調(diào)控神經(jīng)元再生的分子機(jī)制作初步探討。方法：采用選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)(30mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為24小時(shí))抑制nNOS活性，然后用

5、BrdU(50mg/kg，連續(xù)給藥6次，給藥間隔為12小時(shí))標(biāo)記新生細(xì)胞，觀察生理狀態(tài)下抑制nNOS對(duì)海馬DG區(qū)細(xì)胞的增殖和存活的影響；同時(shí)我們用BrdU/NeuN對(duì)新生細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記，以鑒定新生細(xì)胞的表型。為進(jìn)一步探討nNOS調(diào)控神經(jīng)元再生的分子機(jī)制，我們用分別給小鼠腹腔注射7-NI(30mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為24小時(shí))，MK-801(1mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為24小時(shí))以及7-NI+MK

6、-801(MK-801在7-NI之前15min給藥)(給藥劑量和方式同上)后，BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞，觀察各組海馬DG新生細(xì)胞的增殖，同時(shí)采用免疫熒光及Westernblot方法檢測(cè)海馬DG區(qū)p-CREB/CREB的表達(dá)。結(jié)果：7-NI抑制nNOS活性后，顯著促進(jìn)了海馬DG區(qū)細(xì)胞的增殖和存活，BrdU/NeuN雙標(biāo)記結(jié)果表明，在給予BrdU4周后，海馬顆粒細(xì)胞層有65﹪的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)被NeuN標(biāo)記，7-NI組小鼠海馬DG區(qū)BrdU

7、+/NeuN+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯高于其溶劑對(duì)照組。且給予7-NI后，海馬DG的CREB磷酸化水平較其溶劑對(duì)照組有顯著增高，而在給予7-NI之前給予NMDA受體拮抗劑MK-801則能夠顯著抑制7-NI誘導(dǎo)的海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生以及CREB磷酸化水平。結(jié)論：nNOS通過(guò)下調(diào)CREB磷酸化水平抑制了海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生，而NMDA受體的正常功能對(duì)于維持DG區(qū)神經(jīng)元再生是不可缺少的。 第二章：腦缺血抑制nNOS表達(dá)激發(fā)成年海馬齒狀回神經(jīng)元

8、再生 目的：大腦中動(dòng)脈阻塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)法制備局灶性腦缺血再灌注模型，觀察局灶性腦缺血再灌注后對(duì)大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生以及nNOS表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討局灶性腦缺血后nNOS調(diào)控海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生的分子機(jī)制。方法：采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈1.5hr，然后再灌注制備局灶性腦缺血模型。RT-PCR方法和Westernblot方法檢測(cè)局灶性腦缺血后nNOS的mRN

9、A水平和蛋白表達(dá)水平。為進(jìn)一步探討缺血后nNOS的表達(dá)與海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生的關(guān)系以及缺血后nNOS對(duì)神經(jīng)元再生的調(diào)控機(jī)制，我們采用選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)(30mg/kg,連續(xù)給藥5次，給藥間隔為24hr)抑制成年大鼠nNOS活性，BrdU(50mg/kg,連續(xù)給藥3次，給藥間隔為12hr)標(biāo)記新生細(xì)胞，觀察其對(duì)海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生的影響，同時(shí)采用Westernblot方法檢測(cè)7-N

10、I在缺血后抑制nNOS活性對(duì)海馬DG區(qū)p-CREB/CREB的蛋白以及iNOS蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：局灶性腦缺血后，nNOS的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平顯著下降，7-NI抑制nNOS活性都能夠顯著促進(jìn)缺血后海馬DG區(qū)的神經(jīng)元再生。缺血后，抑制nNOS活性上調(diào)了iNOS以及p-CREB的表達(dá)水平。結(jié)論：局灶性腦缺血后抑制nNOS表達(dá)促進(jìn)了腦缺血海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生，且缺血后抑制nNOS增強(qiáng)海馬DG神經(jīng)元再生是通過(guò)上調(diào)p-CREB和iNOS

11、表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。 第三章：nNOS通過(guò)影響端粒酶表達(dá)調(diào)控成年海馬齒狀回神經(jīng)元再生 目的：探討生理狀態(tài)下以及腦缺血再灌注后，端粒酶在成年海馬DG區(qū)的表達(dá)及其對(duì)成年海馬DG神經(jīng)元再生的影響，并初步觀察端粒酶對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的影響。此外，進(jìn)一步探討nNOS對(duì)端粒酶表達(dá)的調(diào)控，從而證明nNOS是否通過(guò)影響端粒酶的表達(dá)而調(diào)控成年海馬齒狀回神經(jīng)元再生。方法：采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈1.5hr，然后再灌注制備局灶

12、性腦缺血模型。TRAP法檢測(cè)生理狀態(tài)下以及局灶性腦缺血后海馬DG區(qū)端粒酶的活性。為進(jìn)一步探討端粒酶的表達(dá)對(duì)海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生的影響以及nNOS是否通過(guò)影響端粒酶的表達(dá)調(diào)控成年海馬DG神經(jīng)元再生，我們分別在生理狀態(tài)下給小鼠腹腔注射7-NI(30mg/kg，腹腔注射，連續(xù)給藥5次，給藥間隔為24小時(shí))，端粒酶抑制劑脫氧疊氮胸苷(3'-azido-2',3'-dideoxythymidine，AZT)(100mg/kg，連續(xù)給藥5次，給藥間

13、隔為24小時(shí))以及AZT+7-NI(AZT在7-NI之前15min給藥)(給藥劑量和方式同上)后，BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞，觀察各組動(dòng)物海馬DG新生細(xì)胞的增殖，同時(shí)采用TRAP方法檢測(cè)海馬DG區(qū)端粒酶的表達(dá)。此外，我們?cè)谠?2-15天大鼠取胚胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，觀察AZT(0.5mmol/L)對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。為探討缺血后端粒酶對(duì)海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生的影響，我們?cè)谌毖俟嗪蠼o缺血小鼠腹腔注射AZT(100mg/kg，連續(xù)

14、給藥5次，給藥間隔為24hr)。AZT末次給藥后，即刻給予動(dòng)物BrdU(腹腔注射，50mg/kg，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為12小時(shí))標(biāo)記新生細(xì)胞。為了研究腦缺血后，iNOS、nNOS是否通過(guò)調(diào)節(jié)端粒酶的表達(dá)而調(diào)控神經(jīng)元再生，我們?cè)谌毖俟嗪蠹纯探o缺血小鼠腹腔注射氨基胍(aminoguanadine，AG)(100mg/kg，連續(xù)給藥5次，給藥間隔為24小時(shí))和7-NI(30mg/kg，連續(xù)給藥5次，給藥間隔24h)，末此給藥6hr后，處

15、死動(dòng)物，提取兩側(cè)海馬的端粒酶進(jìn)行端粒酶活性分析。結(jié)果：生理狀態(tài)下AZT顯著抑制了成年小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生,并削弱了7-NI誘導(dǎo)的海馬DG區(qū)神經(jīng)元再生增加。在生理狀態(tài)下，我們?cè)趯?duì)照組以及7-NI組均未檢測(cè)到DG區(qū)端粒酶的表達(dá)，然而，在腦缺血后第4d，端粒酶的活性顯著升高，且缺血后抑制端粒酶活性顯著削弱了腦缺血誘導(dǎo)的海馬DG區(qū)新生細(xì)胞的增殖。我們?cè)隗w外培養(yǎng)的大鼠胚胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞中加入(0.5mmol/L)AZT，發(fā)現(xiàn)AZT顯著抑制了大鼠