GABA能抑制對小鼠下丘神經(jīng)元時間反應特性的影響.pdf

1、感覺信息在中樞的編碼方式一直是感覺系統(tǒng)研究領域中的一個熱點。聽覺系統(tǒng)是重要的感覺系統(tǒng)之一，被認為是研究中樞對外在信息處理機制的理想模型。聲音信息的編碼機制在對聽覺功能和機制的研究中占重要地位，但頻率和聲強作為聲音的兩個基本參數(shù)，其編碼機制尚不明確。傳統(tǒng)觀念認為動作電位發(fā)放數(shù)（率）編碼了聲音參數(shù)。近十幾年來，動作電位的產(chǎn)生時間，尤其是第一動作電位潛伏期（first spike latency，F(xiàn)SL），由于其可能攜帶的大量感覺信息，引起了

2、越來越多的關注。在聽覺系統(tǒng)研究中，F(xiàn)SL通常定義為從聲音刺激的開始到第一個動作電位發(fā)放出現(xiàn)之間的時間間隔。本實驗室前期研究確定了FSL表征聲刺激強度和頻率遠較動作電位數(shù)（率）更為穩(wěn)定、準確，并表現(xiàn)出高度的同一性。因此有必要對FSL的產(chǎn)生機制、影響因素進行深入研究。 哺乳動物中腦下丘作為聽覺系統(tǒng)的重要中繼核團，在時空信息編碼及時空整合中扮演重要角色。下丘神經(jīng)元接受興奮性和抑制性輸入。其抑制性輸入主要為γ-氨基丁酸（Gamma-am

3、inobutyric acid，GABA）能和甘氨酸（glycine，Gly）能。離子微電泳GABA和Gly拮抗劑荷包牡丹堿、馬錢子堿可改變下丘神經(jīng)元的聲反應特征。此類研究多集中在蝙蝠上，主要以動作電位數(shù)為觀察指標，而對FSL影響的報道很少。下丘不僅接受聽覺通路上行傳導纖維也接受離皮層的下行傳導纖維。下行傳導纖維來自聽覺離皮層系統(tǒng)，即起自聽皮層直接和間接投射到皮層下聽覺核團甚至耳蝸的下行纖維。離皮層系統(tǒng)可改變下丘神經(jīng)元的聲音反應特性，如

4、閾值、最佳響應頻率等。但離皮層系統(tǒng)是否影響下丘神經(jīng)元FSL和時間反應特性尚未見相關報導。 本實驗室的前期研究表明，神經(jīng)元FSL主要由傳遞延時和效能延時兩部分組成。傳遞延時也稱最小延時，不因刺激強度改變而變化，包括聲刺激傳遞到內(nèi)耳毛細胞聲傳延時、沿軸突傳遞的動作電位傳遞延時，以及經(jīng)突觸的固有傳遞時間。而效能延時是因刺激強度而改變的延時。本實驗采用BALB/c小鼠，用在體細胞外方法記錄下丘聽覺神經(jīng)元對聲音刺激的時間反應特性，并比較下

5、丘微電泳荷包牡丹堿（BMI）和聽皮層給予BMI后下丘神經(jīng)元時間反應特性改變，以期解決以下三個主要問題：1、GABA抑制作用是否參與了下丘神經(jīng)元FSL形成，GABA作用的環(huán)節(jié)在哪里；2、FSL的變化對信息表征的意義；3、聽覺下行傳導通路是否影響下丘神經(jīng)元FSL。 細胞外記錄在隔音防回聲的屏蔽室內(nèi)完成。先將置于自制的塑料泡沫模子中的BALB/c小鼠懸掛在防震臺的支架上，接著以固定在顱頂平面長約1.5 cm的平頭金屬釘固定動物頭部。而

6、后在下丘部位頭骨鉆孔，剝離硬腦膜，暴露下丘表面。被用于研究下行通路作用的小鼠同時暴露同側聽皮層。分別以多管和單管微電極進行在體細胞外記錄，記錄并分析局部微電泳BMI和聽皮層給予BMI后下丘神經(jīng)元對聲刺激產(chǎn)生的FSL改變。 聲刺激由位于實驗動物頭部正前方30cm處的揚聲器發(fā)出，為自由場給聲方式。所有聲音信息都是由三個基本參量構成，即聲刺激的頻率、強度和時長。本實驗采用相當于只刺激某一基底膜部位的純頻聲刺激，即單一頻率聲音，其幅度由

7、包絡波控制。包絡波分為上升部分（起始部分，onset）、穩(wěn)態(tài)部分（steady-state）和下降部分（結束部分，offset）。實驗室通常經(jīng)以下參數(shù)控制聲刺激包絡波：上升時間（rise time，RT）、上升函數(shù)（rise function，RF）和下降時間（fall time，F(xiàn)T）及下降函數(shù)（fall function，F(xiàn)F）和穩(wěn)態(tài)聲強（即最大聲強，steady-state pressure，SP）。將聲音包絡波參數(shù)設定為時程50

8、 ms，上升和下降時間分別為20和5 ms，上升函數(shù)為余弦平方函數(shù)。以上聲音參數(shù)通過Tucker-DavisTechnologies系統(tǒng)3來編輯，通過計算機用BrainWare軟件控制和改變刺激強度和頻率。 聲刺激誘導神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位。信噪比大于4：1的電信號視為動作電位，具有相同波形特性的動作電位確定為單單位。單單位動作電位被認為來自于單個神經(jīng)元。確定單個神經(jīng)元反應后，通過改變短純音刺激的頻率和強度（頻率-強度掃描），記錄神

9、經(jīng)元對聲刺激的頻響特性。以動作電位數(shù)（率）為指標，確定該神經(jīng)元的特征頻率（characteristic frequency，CF）和最小閾值（minimum threshold，MT）。最小閾值是神經(jīng)元對30%相同聲刺激產(chǎn)生反應的最小聲刺激強度，特征頻率是神經(jīng)元對最小聲刺激強度產(chǎn)生反應時的聲刺激頻率。然后，在下丘神經(jīng)元局部微電泳GABAA受體拮抗劑BMI和昕皮層給予BMI，再重復頻率-強度掃描。記錄數(shù)據(jù)后，離線計算神經(jīng)元對相同聲刺激產(chǎn)生

10、動作電位的平均FSL。分別以動作電位數(shù)和FSL為指標，分析局部微電泳BMI和聽皮層給予BMI對下丘神經(jīng)元聲反應特性的影響，從而確定GABA抑制作用和聽覺下行傳導通路對下丘神經(jīng)元FSL的影響及其影響成份，并進一步闡明FSL變化的生物學意義。 實驗共記錄到88個下丘神經(jīng)元反應。神經(jīng)元特征頻率分布在7.5～38 kHz，最低閾值范圍10～80 dB SPL，最低閾值與特征頻率之間沒有特定關聯(lián)。下丘神經(jīng)元的頻率調(diào)諧曲線主要為V型，其次為

11、U型，另有少量的多峰型和寬帶型。在淺麻醉狀態(tài)下，下丘神經(jīng)元自發(fā)放電很少，神經(jīng)元的動作電位發(fā)放模式分為相位型（phase）、相位緊張型（phasic-tonic）、準緊張型（quasi-tonic）和緊張型（tonic）四類。以動作電位發(fā)放數(shù)為指標，神經(jīng)元對某一純音反應的發(fā)放數(shù)-強度曲線分為非單調(diào)型（non-monotonic）、單調(diào)型（monotonic）、飽和型（saturate）_種類型，且同一神經(jīng)元對不同頻率聲刺激可呈現(xiàn)不同的反應

12、類型；神經(jīng)元對某一強度下不同頻率聲刺激的發(fā)放數(shù)-頻率反應曲線雖總體呈現(xiàn)倒V型，但變異性較大。而以FSL為指標時，神經(jīng)元對不同頻率反應的FSL-強度曲線只表現(xiàn)為潛伏期隨聲強衰減而單調(diào)延長的特性；神經(jīng)元對不同強度下的FSL-頻率反應曲線呈V型或W型，神經(jīng)元的最小潛伏期總是對應于特征頻率。這種反應特性表明潛伏期對聲刺激強度和頻率表征更穩(wěn)定和準確。神經(jīng)元對不同頻率反應的FSL-強度曲線，可由心理物理學上Pieron法則來描述：y=Ai×e（-x

13、/ti）+y0i，其中y為神經(jīng)元對聲刺激反應的FSL，x是用dB SPL表示的刺激聲音幅度，y0，A，t為三個擬合常數(shù)。y0是當X軸聲強接近無限時曲線上的延時，即最小延時（MFSL），i代表不同的頻率。實驗結果表明，聲刺激的頻率不同，y0，A值不同，而t卻不受刺激頻率的影響；不過不同神經(jīng)元其t值不同。 88個下丘神經(jīng)元中有38個進行了局部微電泳BMI實驗。微電泳BMI后，97.4%（37/38）的神經(jīng)元發(fā)放數(shù)增高，動作電位發(fā)放類

14、型多由相位型轉變?yōu)橄辔痪o張型和緊張型。大多神經(jīng)元（30/38）特征頻率不改變，有8個神經(jīng)元的特征頻率發(fā)生漂移，偏移幅度在±0.5～3 kHz間。特征頻率偏移與神經(jīng)特征頻率間沒有關聯(lián)。22個（57.9%）神經(jīng)元最小閾值下降，12個（31.6%）神經(jīng)元最小閾值不變，4個（10.5%）神經(jīng)元出現(xiàn)最小閾值上升；微電泳BMI所致的最小閾值變化與神經(jīng)元最小閾值呈一定線性關系（y=-0.3138x+5.8495 R2=0.3492）。最小閾值?。?2

15、0 dB SPL）的神經(jīng)元，其最小閾值增高，最小閾值大（>20 dB SPL）的神經(jīng)元，微電泳BMI降低其最小閾值，而且最小閾值越大其變化幅度也大；通常神經(jīng)元對非特征頻率反應的閾值改變較特性頻率的大。38個下丘神經(jīng)元最小潛伏期范圍在9.62～34.13（15.39±5.62）ms。微電泳BMI使27個神經(jīng)元FSL縮短、8個神經(jīng)元FSL延長，3個神經(jīng)元FSL不變。給藥后FSL-強度曲線經(jīng)水平或/和垂直移動可與給藥前FSL-強度曲線重合，表

16、明微電泳BMI并不改變神經(jīng)元的FSL-強度反應特性，即曲線斜率。垂直移位代表MSFL改變，水平移位代表神經(jīng)元最小閾值變化。特征頻率改變的8個神經(jīng)元中，6個神經(jīng)元曲線垂直移位，即MFSL改變；而特征頻率未變的30神經(jīng)元中，有25個曲線只呈水平移位，即微電泳BMI只改變了神經(jīng)元閾值。基于上述結果，本文得出結論，GABA參與小鼠下丘神經(jīng)元FSL形成，從FSL-聲強曲線變化關系可以推斷阻斷GABAA受體可以改變最小閾值和MFSL，即信息傳遞與整

17、合的突觸效能和突觸群。由于MSFL改變往往伴隨神經(jīng)元特征頻率的變化，因此本研究結果還提示，深入研究MFSL與特征頻率的變化關系，不僅可完善聽覺中樞的時間編碼原理，還可能闡明聽覺中樞時間編碼聲刺激頻率特性的機制。 下丘神經(jīng)元接受離皮層系統(tǒng)的廣泛調(diào)節(jié)作用。給予小鼠聽皮層荷包牡丹堿，觀察了皮層神經(jīng)元GABAA受體阻斷下對下丘神經(jīng)元反應潛伏期的影響。88個神經(jīng)元中有25個神經(jīng)元進行了離皮層作用研究。在皮層荷包牡丹堿作用后，下丘神經(jīng)元動作

18、電位發(fā)放數(shù)減少或不變；神經(jīng)元的最小閾值變化則以上升和保持不變?yōu)橹鳎謩e占神經(jīng)元總數(shù)的52%（13/25）和44%（11/25）；FSL延長的神經(jīng)元有16個（64%），F(xiàn)SL縮短的神經(jīng)元有3個（12%），F(xiàn)SL不變的神經(jīng)元有6個（24%）。FSL對聲強的表達關系仍為FSL隨聲強衰減而單調(diào)延長，F(xiàn)SL與頻率關系仍為特征頻率下FSL最短，偏離特征頻率越遠FSL越長。因此，可以推斷皮層神經(jīng)元GABAA受體阻斷后對下丘神經(jīng)元主要起抑制作用，但不改