大鼠三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元對GABA的反應及其相關發(fā)育學研究.pdf

1、眾所周知，γ-氨基丁酸(GABA)是廣泛分布于哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質，它可與相應的GABA受體結合從而發(fā)揮相應的生理功能。以往有諸多研究觀察到GABA能神經(jīng)終末圍繞在三叉神經(jīng)中腦核（mesencephalic trigeminal nucleus, Vme）神經(jīng)元的胞體周圍。本實驗組以往的研究也在超微結構水平進一步證實了GABA能神經(jīng)終末與Vme神經(jīng)元的胞體形成突觸聯(lián)系；同時在Vme神經(jīng)元胞體上還觀察到GAB

2、AARα1 和GABAARα3 受體亞型的表達。雖然已有文獻報道了腦片上Vme神經(jīng)元對GABA的興奮性反應，但由于方法學的局限性，GABA在Vme神經(jīng)元內的反應及其可能的分子基礎仍不明確，負責氯離子轉運的陽離子-Cl-共轉運體可能參與該反應過程，但相關的研究到目前為止尚未見報道。 陽離子-Cl- 共轉運體在維持細胞內外Cl- 濃度的平衡方面發(fā)揮主要作用。 在目前報道的七種陽離子-Cl- 共轉運體中，神經(jīng)系統(tǒng)內僅表達K

3、CC1、KCC2、KCC3 和NKCC1 四種陽離子-Cl- 共轉運體。其中，KCC2 負責將神經(jīng)元內Cl-向外轉運，而NKCC1 則負責將胞外的Cl- 向胞內轉運，二者在神經(jīng)元胞膜上構成一對平衡體，從而維持神經(jīng)元內Cl-濃度的穩(wěn)定和平衡。生后發(fā)育過程中大鼠Vme神經(jīng)元內KCC2 和NKCC1 的表達及其變化，到目前為止鮮見報道，而這種表達的變化可能與氯通道開放后的作用效果有密切聯(lián)系。 小白蛋白（Parvalbumin, PV

4、）是鈣結合蛋白的一種。已有研究表明：發(fā)育過程中，PV 特異性地表達于本體感覺初級傳入神經(jīng)元（如大的背根節(jié)和Vme 等）胞體和突起上。目前，PV 作為研究本體感覺初級傳入神經(jīng)元的特異性標志物已被廣泛應用在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育學研究領域。此外，有關Vme的生后發(fā)育研究亦表明，PV 幾乎表達于所有的Vme 神經(jīng)元中。但是，NKCC1、KCC2 與PV 在Vme 的生后發(fā)育過程中是否有共存，其共存的比例是否有變化，而這種相對量上的變化與蛋白表達水平改

5、變的實際情況是否相符也無明確的答案。 基于此，本論文進行了如下研究：(1) 運用機械分離帶終扣的單細胞膜片鉗技術對大鼠Vme 神經(jīng)元對GABA 的反應進行觀察；(2) 運用Westernblotting 技術結合圖像分析方法觀察生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內NKCC1和KCC2 的表達變化；(3) 運用免疫熒光組織化學雙重標記技術對生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內NKCC1 和KCC2 與PV 之間的共存關系進行了系統(tǒng)觀眾所周知

6、，γ-氨基丁酸(GABA)是廣泛分布于哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質，它可與相應的GABA受體結合從而發(fā)揮相應的生理功能。以往有諸多研究觀察到GABA能神經(jīng)終末圍繞在三叉神經(jīng)中腦核（mesencephalic trigeminal nucleus, Vme）神經(jīng)元的胞體周圍。本實驗組以往的研究也在超微結構水平進一步證實了GABA能神經(jīng)終末與Vme神經(jīng)元的胞體形成突觸聯(lián)系；同時在Vme神經(jīng)元胞體上還觀察到GABAARα

7、1 和GABAARα3 受體亞型的表達。雖然已有文獻報道了腦片上Vme神經(jīng)元對GABA的興奮性反應，但由于方法學的局限性，GABA在Vme神經(jīng)元內的反應及其可能的分子基礎仍不明確，負責氯離子轉運的陽離子-Cl-共轉運體可能參與該反應過程，但相關的研究到目前為止尚未見報道。 陽離子-Cl- 共轉運體在維持細胞內外Cl- 濃度的平衡方面發(fā)揮主要作用。 在目前報道的七種陽離子-Cl- 共轉運體中，神經(jīng)系統(tǒng)內僅表達KCC1、

8、KCC2、KCC3 和NKCC1 四種陽離子-Cl- 共轉運體。其中，KCC2 負責將神經(jīng)元內Cl-向外轉運，而NKCC1 則負責將胞外的Cl- 向胞內轉運，二者在神經(jīng)元胞膜上構成一對平衡體，從而維持神經(jīng)元內Cl-濃度的穩(wěn)定和平衡。生后發(fā)育過程中大鼠Vme神經(jīng)元內KCC2 和NKCC1 的表達及其變化，到目前為止鮮見報道，而這種表達的變化可能與氯通道開放后的作用效果有密切聯(lián)系。 小白蛋白（Parvalbumin, PV）是鈣結

9、合蛋白的一種。已有研究表明：發(fā)育過程中，PV 特異性地表達于本體感覺初級傳入神經(jīng)元（如大的背根節(jié)和Vme 等）胞體和突起上。目前，PV 作為研究本體感覺初級傳入神經(jīng)元的特異性標志物已被廣泛應用在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育學研究領域。此外，有關Vme的生后發(fā)育研究亦表明，PV 幾乎表達于所有的Vme 神經(jīng)元中。但是，NKCC1、KCC2 與PV 在Vme 的生后發(fā)育過程中是否有共存，其共存的比例是否有變化，而這種相對量上的變化與蛋白表達水平改變的實際

10、情況是否相符也無明確的答案。 基于此，本論文進行了如下研究：(1) 運用機械分離帶終扣的單細胞膜片鉗技術對大鼠Vme 神經(jīng)元對GABA 的反應進行觀察；(2) 運用Westernblotting 技術結合圖像分析方法觀察生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內NKCC1和KCC2 的表達變化；(3) 運用免疫熒光組織化學雙重標記技術對生后發(fā)育過程中Vme 神經(jīng)元內NKCC1 和KCC2 與PV 之間的共存關系進行了系統(tǒng)觀察。本論文包括以

11、下三個部分的內容： 第一部分 大鼠三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元對GABA 的反應 本研究運用機械分離帶終扣的單細胞膜片鉗技術觀察Vme神經(jīng)元對GABA的反應情況，結果如下：在鉗制電壓為-70 mV時，給予1 μM TTX、10 μM AP-5 和10 μM CNQX情況下，在所有被檢測的Vme神經(jīng)元上均記錄到內向的mPSCs, mPSCs的平均幅值為24±20 pA，mPSC的反轉電位約為-30mV，與運用Nernst

12、方程計算出的Cl- 平衡電位相當；同時給予GABAA受體特異性拮抗劑Bicuculline (5 μM )時，已觀察到的突觸前GABA所引起的電流被完全阻斷，洗脫后，GABA所引起的mPSCs恢復到先前水平。 以上結果表明：突觸前終扣內釋放的GABA與分布于突觸后的GABAA受體結合從而發(fā)揮對Vme神經(jīng)元的調控作用，GABAA受體激活后，氯離子通道開放，Vme神經(jīng)元胞體內外氯離子流動構成了GABA對Vme神經(jīng)元的作用基礎。

13、 第二部分 大鼠生后發(fā)育過程中三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元內NKCC1 和KCC2 的表達及其變化 本研究分別選取生后0、4、7、10、14、21 的正常雄性大鼠，應用免疫組織化學及Western blotting 技術結合圖像分析對Vme 神經(jīng)元內KCC2 和NKCC1 的表達變化進行了觀察。結果顯示：（1）NKCC1 均表達于Vme 神經(jīng)元的胞體，突起上無表達；（2）生后0 天（P0）大鼠Vme 神經(jīng)元內NKCC1已開始

14、表達，但表達相對較低，隨著發(fā)育時間的延長，NKCC1 的表達逐漸增強，至P10 時已達成年水平。運用Image-pro plus 軟件進行灰度分析顯示，P0、P4、P7、P10、P14、P21 六個不同日齡大鼠Vme 內NKCC1 的灰度值逐漸增大，P0、P4、P7 三個日齡表達水平分別與P10、P14、P21 三個日齡的表達水平相比較存在顯著性差異（P< 0.05）；而KCC2 的表達從P0 至P21時均較弱，各日齡間無差異（P> 0

15、.05）。 本部分研究結果表明在大鼠Vme 神經(jīng)元生后發(fā)育過程中，NKCC1 呈逐漸高水平表達，而KCC2 始終低水平表達，提示成年時Vme 神經(jīng)元胞體中氯離子濃度水平較高，推測胞內氯離子濃度隨發(fā)育不斷增高可能與成年時GABA 對Vme 神經(jīng)元的作用密切相關。 第三部分 大鼠生后發(fā)育過程中三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元內NKCC1、KCC2 與PV 的共存研究 本研究運用免疫熒光雙標技術分別觀察了大鼠P4、P7

16、、P10、P14、P21五個時間點NKCC1、KCC2 與PV 的共存情況，并進行了統(tǒng)計分析。結果顯示：隨著發(fā)育，NKCC1 與PV 的共存率逐漸升高，到成年時NKCC1 幾乎表達于所有的Vme 神經(jīng)元上。而KCC2 在Vme 神經(jīng)元上幾乎觀察不到表達，在五個不同時間點，均未觀察到任何雙標記神經(jīng)元。而在陽性對照實驗中，在小腦的蒲肯野氏細胞層能觀察到明顯的KCC2 的表達。本部分研究結果進一步提示成年后NKCC1 高水平表達而KCC2 的