神經(jīng)肽Y對大鼠皮層神經(jīng)元NMD電流和大鼠癲癇發(fā)作的影響及其作用機制.pdf

1、癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，主要特征是由大腦神經(jīng)元反復異常放電導致的暫時性腦功能失常。近年來，研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作區(qū)域會出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生，突觸重建等大腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化，而這些可塑性變化又使得癲癇呈現(xiàn)反復發(fā)作的特點，是癲癇頻繁發(fā)作和難治的主要原因之一。以往的研究認為神經(jīng)膠質(zhì)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)中僅僅起到支持、營養(yǎng)、保護作用，隨著對神經(jīng)膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中所起作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞在包括癲癇在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中

2、起著重要作用。神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元細胞以外的另一大類細胞，其數(shù)量為神經(jīng)元細胞的(10～50)倍。神經(jīng)膠質(zhì)細胞廣泛分布于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要有星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。正常狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞可在細胞內(nèi)將具有神經(jīng)毒性的谷氨酸轉(zhuǎn)變成無毒性的谷氨酰胺，對大腦起到保護作用。星形膠質(zhì)胞還可通過對鉀的緩沖作用維持神經(jīng)元周圍內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是維持神經(jīng)元正常興奮性的基礎(chǔ)。研究表明，癲癇發(fā)生區(qū)域的

3、星形膠質(zhì)細胞對谷氨酸的攝取和滅活能力降低，谷氨酰胺合成減少，對鉀的緩沖作用減弱，這可能是導致該區(qū)域神經(jīng)元的興奮性增高，誘發(fā)癲癇的反復發(fā)作的原因之一。小膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性激活及隨后發(fā)生的級聯(lián)反應(yīng)對難治性癲癇的發(fā)生有重要意義。其對神經(jīng)元的影響途徑可能包括:1.不斷激活的小膠質(zhì)細胞分泌活性物質(zhì)，誘發(fā)興奮性氨基酸的釋放，增加神經(jīng)元興奮性。2.早期激活的小膠質(zhì)細胞可以釋放轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素-10(IL-10)等抗炎細胞因子，

4、其中TGF-β具有明確的神經(jīng)保護和抗凋亡作用，表明在反應(yīng)初期小膠質(zhì)細胞可能通過分泌有修復損傷能力的生長因子起到保護神經(jīng)元作用。3.小膠質(zhì)細胞聚集增生可形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)，參與神經(jīng)損傷時瘢痕組織的形成。4.小膠質(zhì)細胞持續(xù)活化可以誘發(fā)強烈炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生和釋放IL-1β和TNF-α等大量炎癥因子，提高神經(jīng)元NMDA受體表達，增加其活性，誘發(fā)癲癇的發(fā)生。小膠質(zhì)細胞的激活后產(chǎn)生的NO等生物活性物質(zhì)也可以加重NMDA引起的神經(jīng)毒性。發(fā)生炎癥反應(yīng)時，小膠質(zhì)

5、細胞分泌的細胞因子和氧自由基等炎癥介質(zhì)可以損傷血腦屏障，使血腦屏障通透性增加，對腦組織的保護作用減弱，腦組織易受損傷。
　　炎癥是機體對損傷的一種防御反應(yīng)，但過度的炎癥反應(yīng)會引起機體組織損傷。癲癇的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，強烈的炎癥反應(yīng)會導致神經(jīng)元損傷，加重癲癇。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細胞，是產(chǎn)生炎癥因子的主要細胞之一。小膠質(zhì)細胞的過度激活及隨后產(chǎn)生的大量炎癥因子可能是導致癲癇反復發(fā)作的因素之一，通過抑制小

6、膠質(zhì)細胞的生物活性，減少某些炎癥因子的產(chǎn)生可能是治療癲癇的一種新的途徑。
　　神經(jīng)肽Y(NPY)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元受到損傷時發(fā)揮著保護作用。過去對其作用機制的研究大部分局限于NPY對神經(jīng)元的保護作用，認為NPY主要通過Y2和Y5受體起到保護神經(jīng)元的作用。最近有研究顯示，NPY可以抑制LPS所致的小鼠小膠質(zhì)細胞N9細胞株的激活，降低N9細胞株的免疫活性，抑制其遷移和吞噬能力以及IL-1β及NO的生成。我們

7、推測NPY有可能通過抑制小膠質(zhì)細胞的激活，減少膠質(zhì)細胞來源的細胞因子的釋放來達到保護神經(jīng)元、抑制癲癇發(fā)作的作用。本實驗采用Elisa法、實時熒光定量PCR法檢測NPY對小膠質(zhì)細胞生成IL-1β和TNF-α的影響，用膜片鉗技術(shù)檢測NPY以小膠質(zhì)細胞為靶點對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元NMDA電流的影響，以及NPY通過作用于小膠質(zhì)細胞進而對動物癲癇發(fā)作的行為學影響，探討NPY通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞生物活性、減弱炎癥反應(yīng)起到保護神經(jīng)元和抗癲癇發(fā)作的作用及其機制

8、，尋找以小膠質(zhì)細胞為靶點的治療癲癇的新途徑。本實驗共分四部分。
　　第一部分、LPS對小膠質(zhì)細胞生成IL-1β、TNF-a的影響
　　目的:以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞為研究對象，比較LPS處理小膠質(zhì)細胞時間與小膠質(zhì)細胞生成IL-1β和TNF-α的時效關(guān)系，尋找能夠使小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量IL-1β、TNF-a的LPS最佳干預(yù)時間，為下一步的實驗提供依據(jù)。
　　方法:培養(yǎng)原代大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞，隨機分為10組，5組為LP

9、S處理組，以含LPS（終濃度為100ng/ml）的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液分別孵育1h、3h、6h、12h、24h。每個LPS處理組均設(shè)平行對照，對照組共5組，用無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育，孵育時間同LPS處理組。孵育結(jié)束后，Elisa方法檢測培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法檢測小膠質(zhì)細胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達水平。
　　結(jié)果:以含LPS的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育原代小膠質(zhì)細胞1h、3h、6

10、h、12h，24h后，各組培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小膠質(zhì)細胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達水平與對照組相比均有顯著性增高(P＜0.05); LPS處理組培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小膠質(zhì)細胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達水平隨著處理時間延長逐漸上升，IL-1β在3小時達到高峰，TNF-α在6小時達到高峰，二者在6小時均處于較高水平，以后隨時間延長逐漸所下降，相鄰LPS處理組間均有顯

11、著性差異。
　　結(jié)論:LPS能夠刺激小膠質(zhì)細胞大量產(chǎn)生IL-1β和TNF-α，這種效應(yīng)與LPS刺激時間相關(guān)，在刺激6小時時IL-1β和TNF-α均處于較高水平。
　　第二部分、NPY對小膠質(zhì)細胞生成TNF-α、IL-1β的影響及其作用機制
　　目的:以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞為研究對象，比較NPY處理后小膠質(zhì)細胞生成TNF-α、IL-1β的變化，探討NPY對小膠質(zhì)細胞生成TNF-α、IL-1β的抑制作用及其作用機理

12、。
　　方法:將培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細胞分為Control組、LPS組、NPY+LPS組、NPY組和BIBP3226+NPY+LPS組。Control組細胞以無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育6h，LPS組細胞以含終濃度為100ng/mL LPS的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育6h，NPY+LPS組細胞是先以含NPY(終濃度為1μmol/L)的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育0.5h，然后加入LPS（終濃度為100ng/mL）繼續(xù)孵育6h。NPY組細胞是以含

13、NPY(終濃度為1μmol/L)無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育細胞6h。BIBP3226+NPY+LPS組細胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226(終濃度為1μmol/L)的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育0.5h，再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入終濃度為100ng/mL的LPS繼續(xù)孵育6h。Elisa方法檢測培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法檢測小膠質(zhì)細胞中IL-1βmRNA和 TNF-αmR

14、NA表達水平。
　　結(jié)果:孵育各組小膠質(zhì)細胞6小時后，LPS組培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-a的含量及細胞中IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表達水平顯著高于Control組(P＜0.05); LPS+NPY組與LPS組相比，IL-1β、TNF-a蛋白和mRNA表達水平明顯降低(P＜0.05)，IBP3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，IL-1β、TNF-a蛋白和mRNA表達水平顯著增高(P＜0.05)，LPS組和

15、IBP3226+NPY+LPS組之間無顯著性差異。NPY組與對照組無顯著性差異。說明NPY明顯降低了小膠質(zhì)細胞來源地TNF-a和IL-1β的產(chǎn)生，這種效應(yīng)可以被BIBP3226阻斷，NPY對未活化的小膠質(zhì)細胞生沒有明顯影響。
　　結(jié)論:NPY通過作用于NPYY1受體降低小膠質(zhì)細胞的生物活性，抑制其生成TNF-a和IL-1β。
　　第三部分、NPY通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的免疫活性影響神經(jīng)元NMDA電流
　　目的:以原代培養(yǎng)的

16、大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞為研究對象，用LPS和NPY處理后的小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育神經(jīng)元細胞，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測神經(jīng)元NMDA電流的變化，探討NPY通過對小膠質(zhì)細胞免疫活性的調(diào)節(jié)影響神經(jīng)元NMDA電流及其可能的作用機制。
　　方法:將培養(yǎng)好的原代小膠質(zhì)細胞分為Control組、LPS組、NPY+LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組。Control組細胞以無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育6h，LPS組細胞以含終濃度為100ng/

17、mL LPS的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育6h，NPY+LPS組細胞是先以含NPY(終濃度為1μmol/L)的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育0.5h，然后加入LPS（終濃度為100ng/mL）繼續(xù)孵育6h。BIBP3226+NPY+LPS組細胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226（終濃度為1μmol/L）的無血清膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液孵育0.5h，再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入終濃度100ng/mL的LPS繼續(xù)孵育6h

18、。6小時后，將Control組、LPS組、NPY+LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組的小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液與神經(jīng)元培養(yǎng)液1∶1混合。培養(yǎng)好的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分為Control組、LPS組、NPY+LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組，每組3個樣本。用上述混合培養(yǎng)液孵育相應(yīng)組別的神經(jīng)元6小時。用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測孵育好的各組神經(jīng)元細胞的NMDA電流(INMDA)，計算電流密度。
　　結(jié)果:膜片鉗檢測顯示，與對照組相

19、比，LPS組神經(jīng)元NMDA電流密度顯著增加(P＜0.05)，而加入NPY后(NPY+LPS組)豐申經(jīng)元的NMDA電流密度顯著降低(P＜0.05)，再加入BIBP3226后（BIBP3226+NPY+LPS組）神經(jīng)元的NMDA電流密度顯著上升(P＜0.05)，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組無顯著差異。
　　結(jié)論:激活后的小膠質(zhì)細胞可以使神經(jīng)元的INMDA增高。NPY通過作用于小膠質(zhì)細胞NPY Y1受體，減輕小膠質(zhì)細胞對

20、神經(jīng)元INMDA的影響，避免神經(jīng)元INMDA的過度增高。這種作用是通過小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的非直接接觸途徑實現(xiàn)的，可能與小膠質(zhì)細胞分泌到細胞外的TNF-a和IL-1β等生物活性物質(zhì)有關(guān)。
　　第四部分、NPY通過小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)免疫途徑對大鼠癲癇發(fā)作行為學的影響
　　目的:以SD大鼠為研究對象，通過觀察經(jīng)過LPS和NPY處理后不同組別的小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液注入大鼠側(cè)腦室后行為學的表現(xiàn)，探討NPY以中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞

21、為靶點對大鼠癲癇發(fā)作的影響。
　　方法:將SD大鼠隨機分為Control組、LPS組、NPY+LPS組、BIBP3226+NPY+LPS組，每組5只。采用第一部分同樣方法培養(yǎng)和純化原代大鼠皮層小膠質(zhì)細胞。采用第三部分方法分組及處理小膠質(zhì)細胞。將各組小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液離心后注入相應(yīng)各組大鼠的側(cè)腦室。觀察各組大鼠的行為學表現(xiàn)。根據(jù)Diehl的分級標準對大鼠癲癇發(fā)作程度進行評估，以Ⅰ-Ⅱ級為輕度發(fā)作，Ⅲ-Ⅳ級重度發(fā)作。
　　結(jié)果

22、:20分鐘內(nèi)，LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組5只大鼠均出現(xiàn)重度癲癇發(fā)作，NPY+LPS組有4只出現(xiàn)輕度癲癇發(fā)作，Control組未見癲癇發(fā)作.LPS組發(fā)作程度顯著高于對照組，NPY+LPS組發(fā)作程度顯著低于LPS組，BIBP3226+NPY+LPS組發(fā)作程度顯著高于NPY+LPS組。LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組發(fā)作程度無明顯差異。
　　結(jié)論:激活后的小膠質(zhì)細胞可以導致大鼠癲癇發(fā)作，這種作用是通過小膠質(zhì)