乳酸對大鼠皮層神經元GABAAR電流衰減的增強效應.pdf

1、在急性分離的神經元和腦片的電生理研究中，很早就有學者發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸A型受體(γ-aminobutyric acid A type receptor,GABAAR)介導的氯離子電流強度隨著時間衰減，而這種衰減可被Mg-ATP和磷酸酶抑制劑orthovanadate抑制，提示GABAAR抑制性功能的維持可能與能量代謝和磷酸化修飾機制相關。2004年，Laschet等發(fā)現(xiàn)GABAARα1亞基磷酸化對于維持GABAAR功能有重要作用。該小組發(fā)

2、現(xiàn)α1亞基磷酸化過程由磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）介導，磷基轉移過程需要GAPDH的糖酵解進程生成的ATP，底物為NAD+、G-3-P、ADP和Mg2+，并主要受GAPDH糖酵解底物G-3-P調控，抑制GAPDH糖酵解功能會引起α1亞基磷酸化水平下降并增強GABAAR電流衰減。而在orthovanadate存在的情況下，抑制GAPDH的糖酵解功能無法對G

3、ABAAR電流發(fā)生顯著影響。繼而Pumain在接受外科手術的癲癇患者的癲癇起源區(qū)周圍組織中發(fā)現(xiàn)GABAAR電流與正常對照組相比其衰減速率和衰減程度顯著增強，GAPDH糖酵解底物G-3-P能夠抑制這種增強的衰減，表明癲癇的發(fā)病機制可能與α1亞基磷酸化受抑制相關，并可能與神經元糖酵解功能損傷存在關聯(lián)。
　　而近年來對星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭機制（Astrocyte-neuron lactate shuttle，ANLS）的研究發(fā)現(xiàn)

4、乳酸（lactate）在神經元的能量代謝中占有重要地位。同時有大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸在神經元內的代謝能夠抑制神經元的糖酵解功能。目前多數學者認為乳酸抑制葡萄糖代謝的主要原因是介導乳酸轉變?yōu)楸?pyruvate)的乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase,LDH）與GAPDH競爭NAD+進而抑制GAPDH介導的糖酵解反應。
　　根據文獻回顧所得資料分析，我們設想乳酸在神經元內的代謝有可能通過抑制GAPDH的糖酵解功能從而

5、影響GAPDH介導的α1亞基磷酸化過程，最終影響GABAAR功能。明確乳酸是否能夠調控GABAAR功能及其可能機制，對于我們理解中樞神經系統(tǒng)功能與能量代謝之間的關系是一種新的拓展，并有可能為我們理解癲癇的發(fā)病機制提供新的思路。
　　目的：
　　1.研究乳酸對神經元的GABAAR功能是否存在影響。
　　2.研究乳酸對GABAAR功能的影響是否與依賴于糖酵解的GABAARα1亞基磷酸化修飾機制有關。
　　方法：

6、>　　1.全細胞膜片鉗技術記錄GABAAR電流方法：3-4周雄性SD大鼠，快速斷頭取腦后，切300μm-400μm厚腦片，選取前額葉皮層神經元進行全細胞記錄。鉗制電壓為-70mV。全細胞記錄人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF）成分(mmol)：NaCl125，KCl2.5，NaH2PO41.25，CaCl22，MgCl21，NaHCO325，D-glucose10，TTX1μmol，CNQ

7、X10μmol，AP-550μmol，pH7.35。電極內液成分(mmol)：CsCl140，CaCl20.5，NaCl4，Hepes10，EGTA1，Mg-ATP4，Na-GTP0.3，pH7.3。GABAAR電流由GABA(100μmol)誘發(fā)。衰減測量程序的GABA(100μmol)給藥方式：每2min給20sGABA刺激，共5次，總計10min。測量每次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值。
　　2.分四個組別：空白對照

8、組，lactate干預組，orthovanadate干預組，orthovanadate+lactate干預組。按照組別，分別在電極內液加入sodium lactate(500μmol),orthovanadate(100μmol),或orthovanadate(100μmol)+sodium lactate(500μmol)，空白對照組不添加lactate或orthovanadate。在使用各組不同電極內液記錄情況下，記錄10min內5

9、次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值。
　　3.依次記錄給藥流程中連續(xù)5次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值，分別記做I1st、I2nd、I3rd、I4th、I5th，以第一次測量的電流峰值（I1st）作為基準，I2nd、I3rd、I4th、I5th分別除以I1st換算成百分比。按組別和時間統(tǒng)計各組數據，以平均值±標準誤表示，根據統(tǒng)計數據建立各組GABAAR電流衰減曲線。使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，檢測各組數據是

10、否滿足方差齊性和正態(tài)分布條件，組間差異檢測方法為ANOVO，p<0.01認為有顯著性差異。分別比較lactate干預組與空白對照組、空白對照組與orthovanadate干預組、lactate干預組與orthovanadate+lactate干預組、orthovanadate+lactate干預組與orthovanadate干預組的GABAAR電流衰減程度。
　　結果：
　　1.空白對照組在衰減測量程序最后一次GABA刺激誘

11、發(fā)的GABAAR電流峰值（I5th）下降至第一次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值（I1st）的79.15％±1.96％（n=16）。
　　2.Lactate干預組的I5th下降至該組I1st的59.78％±3.76％(n=16)，lactate干預組GABAAR電流衰減程度顯著高于空白對照組（ANOVO,p<0.01）。
　　3.Orthovanadate干預組I5th僅下降至該組I1st的96.60％±2.29％，G

12、ABAAR電流衰減程度顯著低于空白對照組（ANOVO,p<0.01）。
　　4.Orthovanadate+lactate干預組I5th僅下降至I1st的92.45％±5.40％(n=12)，GABAAR電流衰減程度顯著低于lactate干預組的GABAAR電流衰減程度（ANOVO,p<0.01），同時與orthovandate干預組相比無顯著差異（ANOVO,p>0.05）。
　　結論：
　　Lactate顯著增強了

13、GABAAR電流的衰減，提示神經元內lactate含量的升高對GABAAR功能有抑制性作用。而orthovanadate幾乎完全抑制了lactate對GABAAR功能的抑制性作用。
　　Orthovanadate能夠特異性地抑制α1亞基去磷酸化過程，Laschet等的實驗發(fā)現(xiàn)，特異性抑制GAPDH的糖酵解功能的iodoacetamide能夠顯著降低GABAARα1亞基磷酸化水平并增強GABAAR電流衰減；而在orthovanada

14、te存在的情況下，iodoacetamide對GABAARα1亞基磷酸化水平和GABAAR電流衰減程度無顯著影響。本實驗的結果發(fā)現(xiàn)lactate對GABAAR功能的調控效應與iodoacetamide類似，提示lactate有可能是通過抑制GAPDH的糖酵解功能進而下調GABAAR的α1亞基磷酸化進程從而負性調節(jié)GABAAR功能。
　　創(chuàng)新點：
　　1.首次發(fā)現(xiàn)神經元胞內乳酸濃度的升高能夠增強GABAAR電流的衰減。