乳酸對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元GABAAR電流衰減的增強(qiáng)效應(yīng).pdf

1、在急性分離的神經(jīng)元和腦片的電生理研究中，很早就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸A型受體(γ-aminobutyric acid A type receptor,GABAAR)介導(dǎo)的氯離子電流強(qiáng)度隨著時(shí)間衰減，而這種衰減可被Mg-ATP和磷酸酶抑制劑orthovanadate抑制，提示GABAAR抑制性功能的維持可能與能量代謝和磷酸化修飾機(jī)制相關(guān)。2004年，Laschet等發(fā)現(xiàn)GABAARα1亞基磷酸化對(duì)于維持GABAAR功能有重要作用。該小組發(fā)

2、現(xiàn)α1亞基磷酸化過(guò)程由磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）介導(dǎo)，磷基轉(zhuǎn)移過(guò)程需要GAPDH的糖酵解進(jìn)程生成的ATP，底物為NAD+、G-3-P、ADP和Mg2+，并主要受GAPDH糖酵解底物G-3-P調(diào)控，抑制GAPDH糖酵解功能會(huì)引起α1亞基磷酸化水平下降并增強(qiáng)GABAAR電流衰減。而在orthovanadate存在的情況下，抑制GAPDH的糖酵解功能無(wú)法對(duì)G

3、ABAAR電流發(fā)生顯著影響。繼而Pumain在接受外科手術(shù)的癲癇患者的癲癇起源區(qū)周圍組織中發(fā)現(xiàn)GABAAR電流與正常對(duì)照組相比其衰減速率和衰減程度顯著增強(qiáng)，GAPDH糖酵解底物G-3-P能夠抑制這種增強(qiáng)的衰減，表明癲癇的發(fā)病機(jī)制可能與α1亞基磷酸化受抑制相關(guān)，并可能與神經(jīng)元糖酵解功能損傷存在關(guān)聯(lián)。
　　而近年來(lái)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元乳酸穿梭機(jī)制（Astrocyte-neuron lactate shuttle，ANLS）的研究發(fā)現(xiàn)

4、乳酸（lactate）在神經(jīng)元的能量代謝中占有重要地位。同時(shí)有大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸在神經(jīng)元內(nèi)的代謝能夠抑制神經(jīng)元的糖酵解功能。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乳酸抑制葡萄糖代謝的主要原因是介導(dǎo)乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸?pyruvate)的乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase,LDH）與GAPDH競(jìng)爭(zhēng)NAD+進(jìn)而抑制GAPDH介導(dǎo)的糖酵解反應(yīng)。
　　根據(jù)文獻(xiàn)回顧所得資料分析，我們?cè)O(shè)想乳酸在神經(jīng)元內(nèi)的代謝有可能通過(guò)抑制GAPDH的糖酵解功能從而

5、影響GAPDH介導(dǎo)的α1亞基磷酸化過(guò)程，最終影響GABAAR功能。明確乳酸是否能夠調(diào)控GABAAR功能及其可能機(jī)制，對(duì)于我們理解中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能與能量代謝之間的關(guān)系是一種新的拓展，并有可能為我們理解癲癇的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　目的：
　　1.研究乳酸對(duì)神經(jīng)元的GABAAR功能是否存在影響。
　　2.研究乳酸對(duì)GABAAR功能的影響是否與依賴于糖酵解的GABAARα1亞基磷酸化修飾機(jī)制有關(guān)。
　　方法：

6、>　　1.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄GABAAR電流方法：3-4周雄性SD大鼠，快速斷頭取腦后，切300μm-400μm厚腦片，選取前額葉皮層神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞記錄。鉗制電壓為-70mV。全細(xì)胞記錄人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF）成分(mmol)：NaCl125，KCl2.5，NaH2PO41.25，CaCl22，MgCl21，NaHCO325，D-glucose10，TTX1μmol，CNQ

7、X10μmol，AP-550μmol，pH7.35。電極內(nèi)液成分(mmol)：CsCl140，CaCl20.5，NaCl4，Hepes10，EGTA1，Mg-ATP4，Na-GTP0.3，pH7.3。GABAAR電流由GABA(100μmol)誘發(fā)。衰減測(cè)量程序的GABA(100μmol)給藥方式：每2min給20sGABA刺激，共5次，總計(jì)10min。測(cè)量每次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值。
　　2.分四個(gè)組別：空白對(duì)照

8、組，lactate干預(yù)組，orthovanadate干預(yù)組，orthovanadate+lactate干預(yù)組。按照組別，分別在電極內(nèi)液加入sodium lactate(500μmol),orthovanadate(100μmol),或orthovanadate(100μmol)+sodium lactate(500μmol)，空白對(duì)照組不添加lactate或orthovanadate。在使用各組不同電極內(nèi)液記錄情況下，記錄10min內(nèi)5

9、次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值。
　　3.依次記錄給藥流程中連續(xù)5次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值，分別記做I1st、I2nd、I3rd、I4th、I5th，以第一次測(cè)量的電流峰值（I1st）作為基準(zhǔn)，I2nd、I3rd、I4th、I5th分別除以I1st換算成百分比。按組別和時(shí)間統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)建立各組GABAAR電流衰減曲線。使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)各組數(shù)據(jù)是

10、否滿足方差齊性和正態(tài)分布條件，組間差異檢測(cè)方法為ANOVO，p<0.01認(rèn)為有顯著性差異。分別比較lactate干預(yù)組與空白對(duì)照組、空白對(duì)照組與orthovanadate干預(yù)組、lactate干預(yù)組與orthovanadate+lactate干預(yù)組、orthovanadate+lactate干預(yù)組與orthovanadate干預(yù)組的GABAAR電流衰減程度。
　　結(jié)果：
　　1.空白對(duì)照組在衰減測(cè)量程序最后一次GABA刺激誘

11、發(fā)的GABAAR電流峰值（I5th）下降至第一次GABA刺激誘發(fā)的GABAAR電流峰值（I1st）的79.15％±1.96％（n=16）。
　　2.Lactate干預(yù)組的I5th下降至該組I1st的59.78％±3.76％(n=16)，lactate干預(yù)組GABAAR電流衰減程度顯著高于空白對(duì)照組（ANOVO,p<0.01）。
　　3.Orthovanadate干預(yù)組I5th僅下降至該組I1st的96.60％±2.29％，G

12、ABAAR電流衰減程度顯著低于空白對(duì)照組（ANOVO,p<0.01）。
　　4.Orthovanadate+lactate干預(yù)組I5th僅下降至I1st的92.45％±5.40％(n=12)，GABAAR電流衰減程度顯著低于lactate干預(yù)組的GABAAR電流衰減程度（ANOVO,p<0.01），同時(shí)與orthovandate干預(yù)組相比無(wú)顯著差異（ANOVO,p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　Lactate顯著增強(qiáng)了

13、GABAAR電流的衰減，提示神經(jīng)元內(nèi)lactate含量的升高對(duì)GABAAR功能有抑制性作用。而orthovanadate幾乎完全抑制了lactate對(duì)GABAAR功能的抑制性作用。
　　Orthovanadate能夠特異性地抑制α1亞基去磷酸化過(guò)程，Laschet等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，特異性抑制GAPDH的糖酵解功能的iodoacetamide能夠顯著降低GABAARα1亞基磷酸化水平并增強(qiáng)GABAAR電流衰減；而在orthovanada

14、te存在的情況下，iodoacetamide對(duì)GABAARα1亞基磷酸化水平和GABAAR電流衰減程度無(wú)顯著影響。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)lactate對(duì)GABAAR功能的調(diào)控效應(yīng)與iodoacetamide類似，提示lactate有可能是通過(guò)抑制GAPDH的糖酵解功能進(jìn)而下調(diào)GABAAR的α1亞基磷酸化進(jìn)程從而負(fù)性調(diào)節(jié)GABAAR功能。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元胞內(nèi)乳酸濃度的升高能夠增強(qiáng)GABAAR電流的衰減。