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文檔簡介
1、目的:采用激光共聚焦鈣離子熒光成像技術(shù)觀察不同亞型載脂蛋白E(apoE4,apoE3)對原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元胞內(nèi)靜息鈣水平和NMDA誘發(fā)鈣反應的影響。 方法:熒光染料選Fluo-3/AM,對皮層神經(jīng)元有效負載后在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并記錄其胞內(nèi)靜息鈣水平或其變化。根據(jù)藥物作用時間將實驗分為急性和慢性兩部分。在急性實驗部分,培養(yǎng)10d的皮層神經(jīng)元洗去培養(yǎng)基,負載染料,先記錄1min的胞內(nèi)靜息鈣水平,然后,分別給予不同濃度
2、的重組人apoE4、apoE3和MK801,動態(tài)觀察胞內(nèi)鈣水平的變化20min。最后給予100μmol/L NMDA,繼續(xù)觀察1min以了解皮層神經(jīng)元對NMDA的鈣反應。在慢性實驗部分,皮層神經(jīng)元培養(yǎng)8d后進行藥物干預,作用48h,洗去培養(yǎng)基,負載染料,觀察胞內(nèi)靜息鈣水平1min;然后給予100μmol/L NMDA,觀察皮層神經(jīng)元NMDA鈣反應1min。 結(jié)果:(1)急性給予apoE4劑量依賴性和時間依賴性升高了細胞內(nèi)的靜息鈣
3、水平。100nmol/L和300nmol/L apoE4給藥后20min,神經(jīng)元胞漿相對鈣熒光強度升高到137.74±6.89%和154.05±7.60%,與對照組(100.42±8.06%)相比具有顯著性差異(P<0.01);同一濃度(300nmol/L)的apoE4在給藥后5min、10min和20min不同時間點,其相對熒光密度分別升高到118.25±8.08%、138.74±7.57%和154.05±7.60%,存在顯著差異(P
4、<0.01)。(2)急性給予apoE4引起的胞內(nèi)鈣水平增高可以被NMDA受體非競爭性拮抗劑MK801部分阻斷。急性給予100nmol/LapoE4引起的[Ca2+]ⅰ升高(137.74±6.89%)被MK801降至116.76±8.35%(P<0.05)。(3)急性給予apoE4同樣顯著性增強了NMDA誘發(fā)的鈣反應。對照組NMDA誘發(fā)的鈣升高為317.86±8.56%,急性給予100nmol/L和300nmol/L apoE4使NMDA
5、(100μmol/L)誘發(fā)的鈣反應增加至335.75±9.65%(P<0.05)和360.78±8.35%(P<0.01)。(4)慢性apoE4預處理也顯著升高了胞內(nèi)鈣水平,并且也被MK801有效阻斷。100nmol/L和300nmol/L apoE4作用48h后[Ca2+]ⅰ顯著升高到172.51±5.40%和201.24±1.29%(P<0.01);MK801則使100nmol/L apoE4引起的[Ca2+]ⅰ升高降至131.04
6、±2.09%(P<0.01)。但慢性apoE4預處理卻使NMDA引起的鈣反應明顯降低。100nmol/L和300nmol/L apoE4作用48h,使NMDA引起的鈣反應峰值從對照組的317.86±8.56%分別降至200.75±9.65%和154.78±8.35%(P<0.01)。(5)即使在高濃度下(300nmol/L),急性、慢性apoE3處理均未引起細胞內(nèi)靜息鈣水平及NMDA鈣反應的顯著改變。 結(jié)論:(1)ApoE4急性
7、作用可以顯著升高神經(jīng)元胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ,且呈濃度依賴與時間依賴效應,而apoE3則無影響;MK-801可減弱apoE4急性作用引起的胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ升高,而MK-801單獨作用無影響;(2)ApoE4急性作用可以明顯增加NMDA誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高,且呈濃度依賴效應,而apoE3則無影響;(3)ApoE4慢性作用可以濃度依賴性地升高神經(jīng)元胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ,而apoE3則無影響,MK-801預處理可減弱apoE4引起
8、的胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ升高,但不能完全阻斷該效應;(4)ApoE4慢性作用可降低NMDA誘發(fā)的胞內(nèi)鈣反應,呈濃度依賴效應,而apoE3則無影響,MK-801預處理可以部分逆轉(zhuǎn)apoE4慢性作用引起的NMDA胞內(nèi)鈣反應降低。 鈣成像實驗結(jié)果提示,即使在生理濃度下,apoE4也可通過激活NMDA受體而擾亂神經(jīng)元胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。由此導致的細胞內(nèi)鈣超載可能是AD發(fā)病早期的關(guān)鍵事件,據(jù)此設(shè)計特異性NMDA受體阻斷劑將有可能成為保護神經(jīng)元免受
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