氧糖剝奪對Cdh1蛋白表達的影響及其在星形膠質細胞反應性增殖中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均出現(xiàn)了星形膠質細胞反應性增殖這一病理過程。星形膠質細胞的反應性增殖對于神經(jīng)元甚至整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)而言,都是有利有弊的,其綜合效應更傾向于有害的方面。研究腦缺血后星形膠質細胞反應性增殖的具體機制并有效抑制其增殖,對于治療缺血性腦損傷具有重要的價值及意義。
　　細胞周期末期促進復合物 APC及其調節(jié)亞基 Cdh1可以通過泛素化降解細胞周期蛋白從而抑制細胞增殖,同時 A

2、PC-Cdh1可以通過調節(jié)果糖-2,6-二磷酸酶3活性調控糖酵解代謝,而糖酵解代謝與細胞增殖互為促進因素,另一方面大鼠全腦缺血性損傷后海馬區(qū) Cdh1蛋白表達下降,因此我們推測,APC-Cdh1在缺血性腦損傷星形膠質細胞反應性增殖中發(fā)揮著重要作用,但其具體機制目前尚不清楚。
　　我們擬通過構建密閉缺氧小室進行氧糖剝奪的方法,在體外模擬缺血性腦損傷后星形膠質細胞的反應性增殖,并通過流式細胞技術及Realtime PCR法檢測細胞周期

3、及Cdh1 mRNA變化,以鑒定模型構建成功;通過不同程度氧糖剝奪的處理,探討氧糖剝奪對星形膠質細胞內 Cdh1蛋白表達的影響,通過對比單純缺氧與氧糖剝奪對Cdh1蛋白表達的影響評估糖代謝與 Cdh1蛋白表達之間的聯(lián)系;通過構建表達大鼠Cdh1基因的重組慢病毒載體,調控 Cdh1活性;通過觀察 Cdh1慢病毒干預對其下游底物的影響以評估其功能,通過其對星形膠質細胞反應性增殖的影響,探討 Cdh1在星形膠質細胞反應性增殖中的作用。

4、　　研究方法與結果：
　　1.大鼠星形膠質細胞反應性增殖模型的構建及鑒定
　　方法:體外純化培養(yǎng)大鼠大腦皮層星形膠質細胞,通過免疫組化法鑒定其純度;構建密閉缺氧小室進行氧糖剝奪處理,通過檢測不同時間點(10min,30min,1h,3h,6h,9h)小室內氧含量及小室內 Earle's平衡液的氧分壓評估氧糖剝奪效果;對星形膠質細胞進行氧糖剝奪1h復氧48h處理,免疫組化雙標法檢測其增殖效應;星形膠質細胞氧糖剝奪3h,6h,9

5、h后,PI單染法流式細胞儀檢測細胞周期改變,Realtime-PCR法檢測 Cdh1及其下游底物細胞周期蛋白 B1的mRNA表達變化。
　　結果:體外成功培育的星形膠質細胞純度>90％;與對照組相比,缺氧小室進行氧糖剝奪各組氧分壓均下降(P<0.05),與10min組相比,其余各組氧分壓均下降(P<0.05),30min組與1h,3h,6h,9h組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);通過氧糖剝奪1h復氧48h處理可引起星形膠質細

6、胞的反應性增殖,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);氧糖剝奪3h不引起細胞處于 S期的比例改變,6h,9h組處于S期的細胞明顯減少(P<0.05);氧糖剝奪3h不引起細胞內 Cdh1及CyclinB1 mRNA水平的變化,6h組 Cdh1 mRNA表達下降,CyclinB1 mRNA表達增多,與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.氧糖剝奪對星形膠質細胞內 Cdh1蛋白表達的影響及機制研究
　　方

7、法:①體外純化培養(yǎng)大鼠大腦皮層星形膠質細胞,隨機分為對照組,氧糖剝奪1h復氧組,氧糖剝奪6h復氧組,對照組常氧培養(yǎng),實驗組分別氧糖剝奪3h或6h后復氧48h,Western blot法檢測 Cdh1及其下游底物 Skp2蛋白的表達變化;②將體外純化培養(yǎng)的星形膠質細胞隨機分為對照組,氧糖剝奪6h組,單純缺氧6h組,分別進行常氧,氧糖剝奪與單純缺氧處理,6h后 Western blot法檢測 Cdh1蛋白的表達變化,血糖儀檢測各組培養(yǎng)液中葡

8、萄糖含量的變化。
　　結果:①與對照組相比,氧糖剝奪1h復氧組,氧糖剝奪6h復氧組 Cdh1蛋白表達均下降,Skp2蛋白表達均增加(P<0.05);②與對照組相比,氧糖剝奪6h組 Cdh1蛋白表達明顯下降(P<0.05),單純缺氧6h組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),氧糖剝奪6h組與單純缺氧6h組兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);單純缺氧6h組細胞外液葡萄糖攝取率低于對照組(P<0.05)。
　　3.表達大鼠Cdh1

9、基因的重組慢病毒載體的構建及鑒定
　　方法:根據(jù)大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亞克隆到慢病毒表達載體 pGC-FU的Age I酶切位點間,命名為 pGC-FU-Cdh1。對 pGC-FU-Cdh1進行 PCR擴增及測序鑒定。將 pGC-FU-Cdh1脂質體法轉染293T細胞,倒置熒光顯微鏡及Western blot檢測其表達情況。慢病毒載體 LV-Cdh1的包裝濃縮及滴度測定。
　　結果:重組慢病毒表達載體

10、pGC-FU-Cdh1經(jīng)PCR擴增、測序鑒定均顯示有特異性基因片斷,證明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表達載體pGC-FU中;pGC-FU-Cdh1轉染293T細胞,倒置熒光顯微鏡及Western blot檢測到Cdh1-GFP的表達;慢病毒載體LV-Cdh1包裝濃縮后,轉染293T細胞,倒置熒光顯微鏡觀測到Cdh1-GFP的表達后, Realtime PCR法測定滴度為2×108TU/ml。
　　4.慢病毒過表達 Cdh1蛋白對

11、星形膠質細胞細胞反應性增殖作用的初步研究
　　方法:體外純化培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞:①隨機分為 Cdh1慢病毒組及空病毒組,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達,Western Blot檢測 Cdh1及Skp2蛋白的表達變化;②隨機分為單純氧糖剝奪/復氧組,Cdh1慢病毒干預組,空病毒干預組,氧糖剝奪1h復氧48h后,CCK-8法及免疫組化雙標法檢測細胞增殖的變化。
　　結果:與空病毒組相比,Cdh1慢病毒組 Cdh1蛋白表達總量

12、增加,Skp2蛋白表達下降(P<0.05);與單純氧糖剝奪/復氧組相比,Cdh1慢病毒干預組細胞反應性增殖受到抑制(P<0.05),空病毒組沒有變化(P>0.05)。
　　研究結論：
　　①在體外成功培育成熟的星形膠質細胞;通過密閉缺氧小室成功進行氧糖剝奪處理,30min后可達穩(wěn)態(tài),并維持缺氧狀態(tài)9h無差異;通過氧糖剝奪1h復氧48h處理引起星形膠質細胞的反應性增殖;星形膠質細胞反應性增殖狀態(tài)不引起 Cdh1 mRNA水平的

13、改變。
　　②氧糖剝奪后星形膠質細胞內 Cdh1蛋白表達減少,其變化與氧糖剝奪時間長短及是否復氧無關;Cdh1蛋白水平的變化與氧糖剝奪時細胞外液中缺少葡萄糖有關。
　?、鄢晒嫿ū磉_大鼠Cdh1基因的重組慢病毒載體LV-Cdh1,包裝的病毒滴度為2×108TU/ml,能在蛋白水平上調 Cdh1的表達,對其下游底物 Skp2蛋白的表達產(chǎn)生影響。
　?、苈《具^表達 Cdh1蛋白對氧糖剝奪再復氧后星形膠質細胞的反應性增殖有