星形膠質(zhì)細(xì)胞對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化的作用研究.pdf

1、近幾十年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如創(chuàng)傷、神經(jīng)退行性疾病、腦血管病等）的發(fā)病率逐年增加，其致殘率和死亡率較高，而成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身的再生能力較弱，目前臨床只能對癥治療，尚無有效的治療方法。近年來，干細(xì)胞（stem cells）移植療法逐漸成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種有前途的治療措施。 干細(xì)胞是一類具有自我更新、自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞，在合適的條件下，可以分化為不同類型的具有特定形態(tài)、特定分子標(biāo)志和特殊功能的成熟細(xì)胞。骨

2、髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal stem cel1s，BMSCs）是來源于骨髓的一種干細(xì)胞。BMSCs可從自體骨髓取材、來源充足、取材方便，是治療性干細(xì)胞移植中比較理想的種子細(xì)胞。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs不僅可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等間充質(zhì)來源的細(xì)胞，在合適的培養(yǎng)條件下，BMSCs還可橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞；并在不同的體內(nèi)微環(huán)境或體外誘導(dǎo)條件下，分化為不同遞質(zhì)類型的神經(jīng)細(xì)胞。因此，BMSCs有望

3、成為干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想種子細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。 星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的一類細(xì)胞，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的主要構(gòu)成成分。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅對神經(jīng)元提供營養(yǎng)、支持、保護(hù)、隔離作用，在神經(jīng)元的發(fā)育、軸突再生、突觸形成和信號傳遞以及干細(xì)胞的分化等方面也發(fā)揮著重要作用。 實(shí)驗(yàn)證明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或發(fā)生神經(jīng)退行性疾病后，炎癥反應(yīng)非常明顯，星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活并分泌一系列炎性細(xì)胞因子是這

4、種炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志。這種炎癥反應(yīng)所形成的微環(huán)境對神經(jīng)組織中固有的神經(jīng)干細(xì)胞或移植的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞會產(chǎn)生什么影響，至今仍不得而知。 本研究利用體外建立的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，研究了激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 一、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和體外擴(kuò)增 由于骨髓中細(xì)胞成分復(fù)雜，且BMSCs在骨髓中的含量很少，約105個骨髓單個核細(xì)胞中僅含2～5個BMSCs，因而

5、BMSCs的分離、培養(yǎng)、純化和體外擴(kuò)增的難度較大。 根據(jù)BMSCs密度比較低和容易貼壁生長的特點(diǎn)，首先用密度為1．077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液將大部分的造血細(xì)胞去除，然后通過貼壁培養(yǎng)、定期換液去除懸浮生長的造血細(xì)胞，使用低糖DMEM培養(yǎng)液（含10％FBS）培養(yǎng)擴(kuò)增。原代培養(yǎng)7天左右，BMSCs可形成明顯的細(xì)胞集落；細(xì)胞生長至80％～90％融合時用0．25％胰蛋白酶-0．02％EDTA消化，傳代培養(yǎng)。傳至3代時，細(xì)胞基本純化，形

6、態(tài)趨于一致，呈長梭形。由于BMSCs缺乏專一的特異性抗原標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了多種細(xì)胞表面抗原，以便確認(rèn)BMSCs。檢測結(jié)果顯示：幾乎所有的培養(yǎng)細(xì)胞，其表面抗原CD29和CD90呈陽性，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為較純的BMSCs。 二、炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對BMSCs增殖及分化的影響 在成功培養(yǎng)BMSCs的基礎(chǔ)上，為模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)體內(nèi)炎性微環(huán)境下星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞對BMSCs增殖及分化的影響，我們首先分別收集加入脂

7、多糖（LPS）培養(yǎng)12、36、72h后的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液作為炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基（astrocyte conditioned medium，ACM，分別稱為12h ACM、36h ACM、72h ACM），同時收集無LPS的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液作為正常星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基（normal ACM，N-ACM），然后將收集的條件培養(yǎng)基加入BMSCs的培養(yǎng)中，觀察細(xì)胞的增殖及神經(jīng)分化情況。 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和N-ACM相

8、比，炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基（12hACM、36h ACM、72h ACM）可明顯促進(jìn)BMSCs的增殖，36h ACM的促增殖作用明顯強(qiáng)于12h及72h ACM兩組。神經(jīng)分化結(jié)果表明，和N-ACM相比，炎性條件培養(yǎng)基可使BMSCs向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化率明顯升高，36h ACM組的神經(jīng)元陽性細(xì)胞比例明顯高于12h ACM和72h ACM兩組；而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化率，12h ACM、36h ACM、72h ACM三組無明顯差異。

9、 三、炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基調(diào)節(jié)BMSCs增殖及分化的機(jī)制研究 第二部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)BMSCs的增殖及神經(jīng)分化，炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞的這種促進(jìn)作用可能是通過分泌的各種因子而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)檢測了白細(xì)胞介素-6（IL-6）。以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，作為一種多功能的炎性細(xì)胞因子，IL-6在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷或疾病中的表達(dá)明顯增加，并在神經(jīng)發(fā)育及再生等過程中發(fā)揮重要作用。為明確IL-6在炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的

10、BMSCs增殖及神經(jīng)分化過程中的作用，我們首先檢測了炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌IL-6的情況。ELISA檢測結(jié)果顯示，炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-6的含量明顯增多，且36h ACM中IL-6的含量明顯高于12h和72h ACM，RT-PCR結(jié)果與此相一致。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加特異性IL-6抗體以阻斷IL-6的作用時，BMSCs的增殖明顯減少，BMSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的趨勢也明顯減弱，但BMSCs向神經(jīng)元方向分化明顯增多，說明IL-