骨髓基質(zhì)干細胞神經(jīng)分化相關(guān)miRNA表達譜研究.pdf

1、目的:通過檢測骨髓基質(zhì)干細胞及其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元細胞中miRNA的表達譜，篩選出誘導(dǎo)分化前后細胞表達的差異性miRNA，尋找可能的骨髓基質(zhì)干細胞神經(jīng)分化特異性的miRNA，為進一步闡明miRNA在骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化中的作用和意義奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法從小鼠骨髓中分離骨髓基質(zhì)干細胞，并在體外進行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。通過瑞氏染色觀察細胞的形態(tài)特點，流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志物，對小鼠骨髓

2、基質(zhì)干細胞進行鑒定。(2)采用β巰基乙醇(BME)，丁羥基茴香醚(BHA)，維甲酸及堿性成纖維生長因子(bFGF)定向誘導(dǎo)小鼠BMSCs向神經(jīng)細胞方向分化，通過免疫熒光染色、Western blot進行鑒定。(3)利用miRNA基因芯片技術(shù)，檢測骨髓基質(zhì)干細胞及其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細胞中miRNA的表達譜，并篩選出小鼠BMSCs神經(jīng)分化前后差異性表達的miRNAs。(4)采用實時熒光定量PCR分析方法，對miRNA基因芯片篩選出的差異miR

3、NA基因進行驗證，利用miRNA靶基因預(yù)測軟件對表達差異最明顯的miRNA進行靶基因預(yù)測。
　　 結(jié)果:(1)經(jīng)密度梯度離心分離法得到的細胞，經(jīng)瑞氏染色后發(fā)現(xiàn)大部分細胞呈現(xiàn)典型的長梭形，經(jīng)貼壁篩選細胞可以進一步純化。經(jīng)過流式細胞儀檢測:細胞表面標(biāo)志物CD73，CD90表達陽性，CD45表達陰性。(2)骨髓基質(zhì)干細胞分化后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞呈現(xiàn)典型的雙極、三極或者多極細胞形態(tài)，可見神經(jīng)樣軸突和胞體的錐樣改變，用免疫熒光染

4、色對經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細胞進行檢測，結(jié)果顯示神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)在分化后的細胞中表達。通過Westernblot檢測NSE在0小時、1小時、3小時、5小時的表達水平，發(fā)現(xiàn)NSE在骨髓基質(zhì)干細胞分化后表達升高，并在分化過程中呈逐漸升高趨勢。(3)用Affymetrix miRNA基因芯片檢測小鼠骨髓基質(zhì)干細胞及其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細胞的miRNAs表達譜，并篩選出分化前后差異性表達的miRNAs。一共有18個miRNAs在分化后表達升高

5、，有4個miRNAs在分化后表達下降。(4)應(yīng)用實時熒光定量PCR的方法驗證篩選出的22條差異miRNA，驗證結(jié)果總體上與芯片檢測的結(jié)果一致，芯片檢測的結(jié)果是可靠的，值得我們進一步分析。
　　 結(jié)論:(1)用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法可以從骨髓中分離得到高純度的骨髓基質(zhì)干細胞，并可在體外培養(yǎng)擴增。β巰基乙醇(BME)，丁羥基茴香醚(BHA)及維甲酸聯(lián)合堿性成纖維生長因子(bFGF)定向誘導(dǎo)小鼠BMSCs，可以使得BMSCs向神