gfap啟動子與骨髓基質干細胞神經膠質分化的篩選

1、9月 第 2 1 鲞 Vo l2G F A P啟動子與骨髓基質干細胞神經膠質分化 的篩選 張 培訓 姜 保 國何 湘 君 趙 富 強魏 光如 張 殿 英傅 中 I g l張 宏波 【 摘要】目的 研究骨髓基質干細胞體外誘導分化， 結合特異性 G F A P啟動子控制的 E G F P的表 達來篩選誘 導的骨髓基質干 細胞。方法 構建 報告載體 0 3 F A P — E G F P ， 原 代培養(yǎng) 的骨髓 基質 干細 胞， 在 陋

2、、 R A 、 f o r s k o h n 、 b F G F 、 P D G F — A A 、 H R G — p 等 復合 物 的誘 導 7d后， p G F A P — E G F P載 體轉 染。 G 4 1 8 抗生索篩選 。熒光顯微鏡下觀察 存活細 胞體 內的 E G F P表達 情況 ， 流 式細胞儀 測定 熒光細胞的 比率 。結果 報告 載 體 p G F A P ． E G F P構建 成功 ， 轉 染骨髓 基質

3、 干 細胞 后部分 細 胞存 活， 流式細 胞儀測 定 8 2 ． 7 4 ％的細胞表達 E G F P 。篩 選出的細胞 G F A P免疫 細胞化 學鑒定陽性 。體 外擴增后可 以得到大 量的 目的細胞 。結論 ．特異性 G F A P啟動子控制 的 E G F P的表達可 以在體外 有效的進行骨髓基質干 細胞的篩選和擴增 。篩選 后的細胞具有 膠質細 胞表型 ， 可提 供足夠 的膠質 細胞進行 神經 系統(tǒng) 的細胞替代治療 。I 關

4、鍵詞】骨髓基質干細胞； 分化； G F A P ； 增強型綠色熒光蛋白；細胞標記 Th ed i f ie r e n t i a t i o ns e l e c t i o no fb o n ema r r o w s t r o ma Ic e l I si n t on e u r a l g l i a le e l I swi t hGFA P p r o mo t e rZ H4G一 z “。 J I A NGB a

5、 o - g u o ， 月 EXi a n g - j “， e ta 1 ． T r a u m a t i cO r t h o p a e d i c so fP e o p l eHo s p i —t a l ， P e k i n gUn i v e r s i t y ， B e i j i n g1 0 0 0 4 4 ， C h i n a【 A b s t r a c t 】O b j e c t i v eT o

6、s t u d yt h eb o n em a r r o ws t r o m a lc e l l sd i f f e r e n t i a t i o ni nv i t r oa n dt Os d e c tt h ed i f f e r e n t i a t e db o n emR r r o w s t r o ma lc e l l swi t ht h eGF APp r o mo t e r — c o

7、 n t r o l e dEGFPe x p r e s s i o n ． M e t h -o d sTh er e p o r tv e c t o rP GFAP — EGF Pwa sr e c o n s t r u c t e d． Th eb o n ema r r o w s t r o ma lc e l l sc u lt u r e dp r i ．ma r i l ya n di n d u c e dwi

8、 t hc o mp o s i t eo fi 3 - ME ， R A。 f o r s k o l i n ， b F G F ， P D G F． A A。 HR G - I Sf o r7d a y s ． B o n ema r r o w s t r o ma lc e H swe r et r a n s f e c t e dwi t hP G 一 EGF Pa n ds e l e c t e dw i t hG

9、4 1 8a n t i b i o t i c ． Th ea l i v eb o n er f l a r r o w s t r o ma lc e U swe r eo b s e r v e du n d e rn u o r e s c e n c emi c r o s c o p ya n df l o w c y t o me t r y． Re s u l t sT h er e p o r tv e c t

10、o r~ 3 F A P — E G F Pwa sr e c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y ． T r a n s f e c ~ e db on ema r r o ws t r o ma lc e l l ss u r v i c e da n d8 2． 7 4％ e x p r e s s e dE GF P． Th ea l l v ec e l l swe rep o

11、 s i t i v ef o rGF AP i mmu n o c ~o c h e mi s t r ys t a i n i n g． Th ea l i v eb o n ema n - o w s t r o ma lc e l l sc ou l db ee n r i c h e di nv i t r o ． Co n c l u s i o nB o n ema r r o w s t r oma lc e l

12、sc a nb es el e ct e da n de n r i c h e d i nv i t r ou n d e rt h eGFAP — c o n t r o l e dEGF Pe x p r e s s i o n ． Th es e l e c t e d c e l l sp o s s e s s e dt h ep h e n o t y p e so fn e u r a l g l i a lc e

13、 l l sa n dc a np r o v i d ep l e n t yo fc e l l sq u a n t i f ie sf o rc e l ls u b s t i —t u t i o nt h e r a p y ?！?K e yw o r d s 】B o n em a F F O Ws t r o m a le e l s ； D i f f e r e n t i a t i o n ；G F A P ；

14、E G F P ； C e l ll a b e l i n g骨髓基質干 細胞 ( MS C s ) 是成年 動物骨髓中保持 分裂和分化潛能的細胞群體?。G F A P可隨著膠質細 胞的成熟而特異性開啟并表達下游的 目的基因。我們 以特異性 G F A P啟動子控制的增強型綠色熒光蛋 白的表達來監(jiān)測 MS C的分化和擴增 ， 旨在探索 一種標 記誘導分化 的 MS C并定 向篩選 神經膠質 細胞， 為臨 床細胞替代療法提供 目的細胞。

15、材料和方法 1 ． 載體構建 ： p G f a 2 一 c L a c Z載體( 美國健康研究所 B r e n n e r 教授惠贈) ， 轉化感受態(tài)大腸桿菌 D H 5 a ， 搖菌 基金項 目： 國家 8 6 3 計劃( 2 0 0 2 A A 2 0 5 0 7 1 ) 。 國家 9 7 3 重大基礎研究 項 目( 2 0 o 1 c c a 0 1 3 0 o )作者單位 ： 1 0 0 0 4 4北京大學 人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科

16、 通訊作者 ： 姜保國 · 實 驗 研 究 ·擴增后大提質粒。B g l Ⅱ一 S a lI酶切 p G f a 2 一 c L a c Z載體 后將 回收得到的小片段 2 ． 2k b的 G F A P啟動子克隆 至經 V s pI — S a | I 酶切后的 p E G F P — N 3載體 ( C l o n t e c h公 司， 北京大學湯富酬惠贈) 中以取代原來的 C MV啟動子， 得到重構的 p G

17、 F A P — E G F P — N 3載體 。割膠 回收 后轉化感受態(tài)大腸桿菌 D H 5 a ， 搖 菌擴增大提。各限 制 性 內切酶 均 購 自華美公 司 。2 ． MS C s 培養(yǎng)： 參照文獻 [ 3 ] 的方法進行成年 S D大 鼠 MS C的分離， 過量 的苯巴 比妥( 2 0 0g ) 殺死大 鼠 后 以ME M( 美 國 G i b e o 公 司) 灌 注 脛 骨 和股 骨 骨 髓 ，灌注液在含 1 0 ％的胎牛

18、血清 ( 美 國 G i b c o公司) 、 2 0 0g ／ I卡那霉 素的 a — ME M 中培 養(yǎng)。同時加入 1 0g ／ L白細 胞 移 動 抑 制 因 子 ( L I F ， 美 國 S i g m a 公 司 ) 以維 持 MS C的分化能力。4 8h 后 更換培養(yǎng)基， 利用 MS C的 貼壁生長特性反復更換培養(yǎng)基來去除血源性細胞。甏 盼 一¨ 二 = = =維普資訊 http://www.cqvip.

19、com 目 l肥 前組組 中 V E G FI{ N A表 ( D A B辯色 4 ∞ )目 2晰 姐 衄 中 V E G Fm R N A柏 讓{ D A B染色 叫 l 川)圈 3常 紐 十 v日 Fr r d c N A( DA B 表 選 4 0 0 )GF A P啟 動子 與 骨髓 基質 干細胞 神 經膠質 分化 的篩選 f 正文 見笫 【 l 0 5頁 一一一～一～蜩㈨醋 柏～～蚴 岫 蠣一維普資訊 http://ww