組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)在胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞分化研究中的應(yīng)用.pdf

1、胚胎干細胞來源于著床前的囊胚內(nèi)細胞團(Inner cell mass，ICM)或桑椹胚，是一大類未分化的二倍體多能干細胞，具有自我更新和多向分化潛能[1]，是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點，在發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)和藥物篩選及新藥開發(fā)等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著日益重要的作用[2]。
　　 神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)是具有高度自我更新能力并能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的多潛能細胞。研究表明，NSC

2、s廣泛存在于發(fā)育期和成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中。在對人胚胎期NSCs的研究中，已先后從大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、嗅球、側(cè)腦室、室管膜下層、小腦和脊髓等區(qū)域分離出NSCs[3]。
　　 熒光蛋白報告基因作為分子標簽，具有易于檢測，靈敏度高；熒光性質(zhì)穩(wěn)定；構(gòu)建載體方便；可直接用于活細胞測定等諸多優(yōu)點，因此在分析生物技術(shù)和細胞內(nèi)分子示蹤方面得到廣泛應(yīng)用，如細菌和病毒學(xué)的研究、利用轉(zhuǎn)基因動物進行基因表達的研究、免疫細胞的遷移、

3、細胞凋亡、蛋白質(zhì)間相互作用、癌癥以及藥物篩選等。近年研究表明，熒光蛋白標記在干細胞的移植、分離純化、示蹤、定量分析及分化狀態(tài)的檢測等方面也具有良好的應(yīng)用前景。
　　 利用組織細胞特異啟動子構(gòu)建熒光蛋白報告基因載體轉(zhuǎn)染干細胞，報告基因的表達需要特異啟動子的激活，通過觀察報告基因的表達可以動態(tài)追蹤干細胞分化過程中相關(guān)基因的表達情況，不僅有助于篩選能誘導(dǎo)干細胞體外特異分化的小分子化合物以及具有發(fā)育毒性的藥物，而且可以純化特定的組織細胞

4、。
　　 有鑒于此，本實驗的主要研究思路，是采用外胚層組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)pLV/Final-puro-Tα1-α-tubulin-hrGFP和pLV/Final-neo-GFAP-dTomato轉(zhuǎn)導(dǎo)人胚胎干細胞和小鼠神經(jīng)干細胞，對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細胞進行誘導(dǎo)分化，對所得到的熒光細胞進行鑒定和分析；因此，本研究主要分為以下二個部分：
　　 第一部分：組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)人胚胎干細胞及其

5、誘導(dǎo)分化的實驗研究。
　　 第二部分：組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠神經(jīng)干細胞及其誘導(dǎo)分化的實驗研究。
　　 第一部分組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)人胚胎干細胞及其誘導(dǎo)分化的實驗研究
　　 1.1目的：
　　 首先通過對分子標記的檢測和體內(nèi)外分化實驗及核型鑒定證明由本實驗室建系的hES細胞株SYSU-10具有自我更新和多向分化潛能。選取外胚層組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的

6、載體系統(tǒng)pLV/Final-puro-Tα1-α-tubulin-hrGFP、pLV/Final-neo-GFAP-dTomato(由本實驗室構(gòu)建)分別轉(zhuǎn)導(dǎo)hES細胞，并使用puromycin、G418分別篩選后獲得攜帶外源基因的純化的hES細胞，然后加入誘導(dǎo)試劑促進hES細胞向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞分化，以獲得表達Tα1-α-tubulin、GFAP的綠色或紅色熒光細胞，并進行相關(guān)的鑒定分析。
　　 1.2方法：
　　

7、1.2.1SYSU-10細胞生物學(xué)特性的分析：對SYSU-10細胞的分子標記及體內(nèi)外分化能力和核型進行檢測。
　　 1.2.2通過分次轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)導(dǎo)入hES細胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天開始使用1-5μg/ml puromycin、300μg/ml G418篩選14天以獲得帶有表達載體的純化的hES細胞。
　　 1.2.3加入各種誘導(dǎo)試劑促進hES細胞向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞分化，以獲得表達Tα

8、1-α-tubulin、GFAP的綠色或紅色熒光細胞，并進行免疫組化和功能染色等的相關(guān)鑒定分析。
　　 1.3結(jié)果：
　　 1.3.1SYSU-10細胞堿性磷酸酶染色為強陽性，鏡下見克隆中細胞密集區(qū)出現(xiàn)紫黑色顆粒，作為對照的飼養(yǎng)層細胞不能被染色。SYSU-10細胞免疫熒光細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示SYSU-10細胞的OCT-4、SSEA-4及TRA-1-60表達強陽性。SYSU-10細胞自然分化過程中，可見表達Albumin的

9、內(nèi)胚層細胞，表達Nestin的外胚層細胞，表達Desmin的中胚層細胞。體內(nèi)分化實驗，將裸鼠處死并取出腫瘤(均具有完整包膜)，進行石蠟切片和HE染色，可見三個胚層來源的細胞類型。SYSU-10細胞核型正常，為46，XX。
　　 1.3.2慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)7天后，加入1-5μg/ml puromycin、300μg/ml G418開始篩選，可以觀察到有大量細胞死亡。篩選兩周后，可以得到具有抗性的攜帶載體系統(tǒng)的純化的hES細胞。
　

10、　 1.3.3加入各種誘導(dǎo)試劑促進hES細胞向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞分化，獲得了表達Tα1-α-tubulin的綠色熒光細胞，通過相關(guān)鑒定分析來源于轉(zhuǎn)導(dǎo)Tα1-α-tubulinhESC的熒光細胞為神經(jīng)元。
　　 1.4結(jié)論：
　　 1.4.1SYSU-10細胞生物學(xué)特性：SYSU-10細胞表達Oct4、SSEA-4、TRA-1-60，在體內(nèi)外可以分化為三胚層的細胞類型。核型正常，為46，XX。
　　 1.4.2

11、成功利用組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)hES細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的hES細胞經(jīng)過篩選獲得純化的細胞群，細胞生長和分化能力不受病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。
　　 1.4.3成功誘導(dǎo)攜帶含組織特異啟動子及熒光報告基因的慢病毒載體的hES細胞分化為表達綠色熒光的特定細胞類型，為以后分化機理和移植治療的研究提供了很好的工具。
　　 第二部分組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠神經(jīng)干細胞及其誘導(dǎo)分化的實驗研究
　　

12、 2.1目的：
　　 選取外胚層組織特異啟動子攜帶熒光報告基因的載體系統(tǒng)pLV/Final-puro-Tα1-α-tubulin-hrGFP、pLV/Final-neo-GFAP-dTomato分別轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠神經(jīng)干細胞(NSCs)并進行純化，然后加入誘導(dǎo)試劑促進NSCs向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞分化，以獲得表達Tα1-α-tubulin、GFAP的綠色或紅色熒光細胞，并進行相關(guān)的鑒定分析。
　　 2.2方法：
　　 2

13、.2.1通過分次轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法分別將兩種慢病毒載體導(dǎo)入NSCs。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天開始使用1-5μg/mlpuromycin、300μg/mlG418篩選7天，以獲得帶有不同表達載體系統(tǒng)的純化的NSCs。
　　 2.2.2加入各種誘導(dǎo)試劑促進NSCs向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞分化，以獲得表達Tα1-α-tubulin、GFAP的綠色或紅色熒光細胞，并進行免疫組化染色等相關(guān)鑒定分析。
　　 2.3結(jié)果：
　　 2.3.1慢病毒轉(zhuǎn)

14、導(dǎo)7天后，加入puromycin、G418開始篩選，可以觀察到有一定量細胞死亡。篩選7天后，可以得到抗puromycin、G418的攜帶載體系統(tǒng)的純化的NSCs。
　　 2.3.2加入各種誘導(dǎo)試劑促進NSCs向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞分化，獲得了表達Tα1-α-tubulin和GFAP的紅色或綠色熒光細胞，通過相關(guān)鑒定分析證實來源于轉(zhuǎn)導(dǎo)Tα1-α-tubulin和GFAP的熒光細胞為早期神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞。
　　 2.4結(jié)