間質(zhì)干細(xì)胞成脂分化熒光報(bào)告基因體系的建立及其應(yīng)用.pdf

1、人體內(nèi)的脂肪細(xì)胞在維持機(jī)體能量代謝平衡和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中具有相當(dāng)重要的作用。脂肪細(xì)胞通過分泌各種各樣的細(xì)胞因子，來調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)包括糖、脂代謝，炎癥反應(yīng)，血管生成等多種生命活動(dòng)。脂肪細(xì)胞的功能失調(diào)將導(dǎo)致各種代謝性疾病的發(fā)生，例如Ⅱ型糖尿病和心血管疾病等。通過篩選作用于脂肪形成過程中的特異性物質(zhì)，如小分子化合物、microRNA或細(xì)胞因子等，我們不僅可以了解脂肪組織的發(fā)育過程，而且能夠從中尋找到治療代謝性疾病的新方法。
　　 目前，絕大

2、多數(shù)的篩選實(shí)驗(yàn)都以小鼠細(xì)胞系作為細(xì)胞模型進(jìn)行檢測，如3T3-F442A等。由于小鼠細(xì)胞與人類細(xì)胞間存在基因序列的差異，小鼠細(xì)胞系并不能作為理想細(xì)胞模型進(jìn)行人體組織細(xì)胞的分化研究。人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(Human mesenchymal stem cell，hMSCs)是一群來源于人體骨髓的成體干細(xì)胞。這群細(xì)胞不僅具有自我更新和多向分化潛能，并且能夠很好的模擬人體內(nèi)脂肪細(xì)胞的形成過程。因此，hMSCs作為人體內(nèi)脂肪形成的天然模擬細(xì)胞，被認(rèn)為是

3、體外研究脂肪形成的理想細(xì)胞模型。
　　 另外，用于高通量篩選的方法主要有三種，即熒光素酶檢測法、抗體標(biāo)記檢測法和熒光報(bào)告基因檢測法。相對而言，熒光素酶檢測法和抗體標(biāo)記檢測法不僅耗時(shí)耗力，而且需要固定或者裂解細(xì)胞，不能夠?qū)崿F(xiàn)“活”細(xì)胞狀態(tài)下的檢測。熒光報(bào)告基因檢測法不單檢測過程簡單易行，其“活”細(xì)胞檢測的優(yōu)點(diǎn)更方便于研究人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察及評價(jià)。而在熒光報(bào)告基因檢測方法的基礎(chǔ)上，引入組織特異性啟動(dòng)子，就能夠特異的指示細(xì)胞的分化狀態(tài)。

4、aP2基因(adipocyte Protein 2)是成熟脂肪細(xì)胞的一個(gè)特異性的標(biāo)志物，同時(shí)也是脂肪形成的一個(gè)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子-PPARgamma(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)的靶基因之一。aP2啟動(dòng)子攜帶熒光報(bào)告基因的方法能夠特異的指示脂肪細(xì)胞的分化過程?；诖耍菊n題建立了基于脂肪細(xì)胞特異性啟動(dòng)子aP2的熒光報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(aP2hrGFP-hMSCs)。通過一系

5、列的鑒定實(shí)驗(yàn)，證明了該系統(tǒng)中熒光報(bào)告基因的表達(dá)與脂肪細(xì)胞的分化情況密切相關(guān)，并且能夠簡易的通過熒光酶標(biāo)儀來檢測熒光報(bào)告基因的表達(dá)情況。最后，利用該系統(tǒng)對已知的成脂相關(guān)小分子化合物進(jìn)行檢測，證明其能夠應(yīng)用于多種物質(zhì)的篩選。
　　 aP2hrGFP-hMSCs作為一種實(shí)時(shí)、靈敏、高效的“活”細(xì)胞檢測系統(tǒng)，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。首先，作為模擬人體脂肪形成過程的天然細(xì)胞模型，它可以應(yīng)用于體內(nèi)脂肪形成的機(jī)理研究，揭示脂肪組織的發(fā)育過程。

6、其次，它能夠?qū)崿F(xiàn)人體脂肪形成相關(guān)物質(zhì)的高通量篩選，有利于代謝性疾病的新藥研究。最后，該模型高效而特異性的檢測優(yōu)勢，還可以服務(wù)于脂肪細(xì)胞相關(guān)的毒理學(xué)研究。
　　 本研究旨在建立aP2hrGFP-hMSCs檢測系統(tǒng)，并且探討其作為脂肪形成研究模型的可行性。本實(shí)驗(yàn)包括以下三個(gè)部分：
　　 第一部分：利用多位點(diǎn)Gateway技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體。獲得pLV/Final-puro-aP2-hrGFP表達(dá)載體，并得到高滴度的病毒原液。

7、
　　 第二部分：hMSCs的轉(zhuǎn)染以及aP2hrGFP-hMSCs的鑒定。證明aP2hrGFP-hMSCs具有與hMSCs一樣的細(xì)胞表型并保持多向分化潛能。通過正常成脂誘導(dǎo)以及成脂抑制劑-Ly294002實(shí)驗(yàn)，證實(shí)熒光報(bào)告基因的表達(dá)能夠準(zhǔn)確的反映aP2基因的變化情況，以及熒光強(qiáng)度能夠通過熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行準(zhǔn)確而快速的檢測。
　　 第三部分：aP2hrGFP-hMSCs檢測系統(tǒng)的應(yīng)用。利用aP2hrGFP-hMSCs檢測Tro