Junctophilin3和4在胚胎干細胞神經分化早期作用研究.pdf

1、Junctophilin3(JP3)和Junctophilin4(JP4)在大腦皮層、海馬及小腦高表達，是一類存在于可興奮細胞中的膜結合蛋白。JP3，4能夠連接細胞膜和內質網膜，形成膜連接復合物，對維持胞內鈣穩(wěn)態(tài)有著重要作用。研究發(fā)現，Jp3,4基因雙敲除的小鼠出生后不但出現嚴重的發(fā)育遲緩及致死率高，而且呈現記憶認知功能損傷和運動協(xié)調功能失常，提示這兩種蛋白在維持動物記憶和運動功能上起重要作用，并在胚胎神經分化發(fā)育過程中的不可或缺性。但

2、其在胚胎發(fā)育過程的表達變化、功能特征以及功能差異尚未見報道。JP3，4能否在神經分化發(fā)育早期便參與神經系統(tǒng)的建立也亟待探索。
　　果蠅表達的JP同源蛋白Undertaker(UTA)，能通過維持吞噬細胞內Ca+平衡來參與凋亡細胞的清理。神經分化過程伴隨大量細胞凋亡，未被及時清理的凋亡細胞則會發(fā)生二次壞死，導致細胞毒性并影響軸突的生長。凋亡的細胞會釋放出“find-me”信號，快速吸引周圍的細胞遷移，同時也會暴露出“eat-me”信

3、號，保證吞噬細胞的識別和吞噬。然而，哺乳動物神經組織JPs是否也具有相同的功能迄今未見報道。除了需要嚴格和適宜的外部環(huán)境，神經元極化及軸突生長還受胞外信號的調控。凋亡細胞能夠召喚周圍細胞的增殖，但是否能對神經極化以及軸突生長產生影響尚未見報道。同時，JP3，4在連接凋亡、吞噬及神經極化之間扮演的角色也亟待闡明。
　　在神經發(fā)育初期，未分化的突起通過競爭，最終只形成單一的軸突，而其他的突起將會停止生長或者變成樹突，該過程使神經元在形

4、態(tài)和功能上都形成了極化。神經元的極化及生長需要局部的Ca2+信號和cAMP，形成局部極化。通過TRPC內流的Ca2+能夠啟動軸突的特化，并激活下游CaMKI等級聯(lián)信號，促使軸突形成。而在軸突切斷的外周神經中，鈣波會沿著軸突傳向胞體，啟動軸突的再生。此外，Ca2+信號還可以和cAMP通路相互作用形成正反饋，放大cAMP信號。在諸多突起中，cAMP濃度最高的突起能夠通過正反饋不斷提升內部cAMP濃度，促使該突起長成軸突，而剩下突起則長成樹突

5、。然而，胞內cAMP信號如何被喚起，Ca2+信號如何在局部區(qū)域被精準調控，基于JP3，4維持的胞內Ca2+平衡是否與此相關聯(lián)尚未完全明確。本論文第一部分將對以上問題做出探索。
　　在軸突和樹突的生長過程，會有過量的軸突分支、突觸以及樹突樹形成，在形成神經環(huán)路后，多余的軸突分支將會被選擇性修剪，以保證神經信號傳遞的專一性。吞噬受體Megf10能夠參與中樞神經系統(tǒng)中突觸的修剪與重塑，Megf10敲除小鼠則保留了過多數量的突觸。果蠅Me

6、gf10的同源蛋白Draper已被發(fā)現能夠參與果蠅胚胎發(fā)育過程的吞噬，而UTA則與Draper協(xié)同完成這一事件。因此，本論文第二部分（附）探索了JP3，4能否在胚胎干細胞分化神經過程中參與軸突的修剪及重塑。
　　Junctophilin-3，-4連接吞噬參與神經極化作用研究
　　本論文第一部分考察了JP3，4參與神經極化的分子機制，探索JP3，4正常表達與Ca+/cAMP形成局部極化的相關性。實驗結果顯示，JP3，4在ES細

7、胞定向分化神經元早期有一過性高表達。在ES細胞沉默Jp3和Jp4，其神經分化早期表達顯著降低，導致Ca2+/cAMP極化正反饋通路受破壞，進而抑制神經極化。抑制JP3，4早期表達高峰使神經前體細胞胞內Ca2+分布失去空間特異性，并導致Ca2+瞬變能力顯著減弱，同時cAMP含量明顯下降，cAMP-LKB1-SAD/MARK2極化通路激活受阻。提示JP3，4早期高表達對維持神經前體細胞胞內局部Ca2+/cAMP極化正反饋通路有重要作用。與此

8、同時，ES細胞定向分化神經早期JP3，4一過性高表達尚與吞噬作用密切相關。神經分化過程伴隨大量凋亡，抑制JP3，4早期表達致使神經前體細胞清理凋亡細胞的效率顯著下降。提示JP3，4在凋亡細胞清理過程需要被大量表達。進一步研究發(fā)現，JP3，4能夠感應凋亡細胞的信號。凋亡細胞的刺激可快速提高JP4及吞噬受體Megf10的表達水平，并可促進JP3與RyR2、RyR3的結合，同時，JP4與Megf10的結合也顯著上調。這些結果提示，除了維持內質

9、網與細胞膜的空間距離，JP3與JP4在功能上各有分工，可分別通過JP3-RyR2，3相互作用及JP4-Megf10相互作用參與吞噬，保證神經極化適宜的微環(huán)境。最后，實驗結果顯示，凋亡細胞刺激可顯著提升胞內cAMP的含量并激活cAMP-LKB1-SAD/MARK2極化通路，促進神經元極化。更為重要的是，凋亡細胞的刺激能夠提升神經前體細胞胞漿Ca2+瞬變能力，易化神經前體細胞極化。該結果提示神經分化發(fā)育過程，凋亡細胞可與神經前體細胞建立聯(lián)系

10、，不僅可誘導其吞噬，同時也能分泌信號促進神經極化及軸突生長，而JP3，4在其中起著橋梁作用。
　　附:JP3，4參與神經分化過程軸突修剪研究
　　本論文第二部分初步探索了JP3，4在神經分化過程參與軸突修剪。實驗結果顯示，通過慢病毒沉默吞噬受體Megf10可導致d8+0 JP3的表達下降，而JP4的表達上調。而沉默JP3則導致Megf10的表達上調，沉默JP4導致Megf10的表達輕微下調，同時沉默JP3，4則會上調Megf

11、10的表達。結合第一部分JP3，4與Megf10的免疫共沉淀結果，提示JP3，4與Megf10之間存在調控關系。在d8+5用凋亡細胞刺激可提升JP4以及Megf10的表達。免疫熒光及電鏡結果表明，在d8+5，細胞的吞噬能力更強，能夠同時吞噬2-3個凋亡細胞或者細胞碎片。此外，神經元之間被發(fā)現存在相互聯(lián)系。進一步研究發(fā)現，在神經分化d8+5，β-tubulinⅢ碎片被包裹于Megf10陽性的細胞中。同時，三維重構的結果也顯示JP3，4陽性

12、的細胞也能吞噬軸突碎片（β-tubulinⅢ陽性）。此外，實驗結果也表明，神經元陽性的細胞不會參與吞噬，而JP3，4及Megf10則大部分分布在神經元陽性細胞以及神經前體陽性細胞中，提示可能有表達JP3，4的膠質前體細胞參與軸突修剪。
　　結論:
　　1.ES細胞分化神經前體細胞過程，凋亡細胞能吸引吞噬細胞觸發(fā)其吞噬作用，并促未成熟神經突極化。JP3和JP4在該過程維持胞內Ca2+平衡并耦聯(lián)這兩個關鍵事件，確保神經突極化的完