在人胚胎干細胞中建立EBV載體系統(tǒng)及其初步應用.pdf

1、中南大學碩士學位論文在人胚胎干細胞中建立EBV載體系統(tǒng)及其初步應用姓名：趙明申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：姚開泰20050501僅包含4個低親和力的EBNA1結合位點，為DNA復制起始區(qū)。在細胞核內表達的EBNA1蛋白通過識別or于能夠有效地增加從胞漿轉入胞核內的oriP質粒量、增強oriP附近啟動子的轉錄活性，并能防止含有oriP的質粒在細胞分裂中丟失。EBV載體避免了傳統(tǒng)病毒載體可能產(chǎn)生的實驗風險，如基因插入失

2、活、突變等。本實驗利用EBV基因組的兩個組分EBNA1和oriP，在hES細胞中建立了EBV載體系統(tǒng)。實驗結果表明，它能夠顯著提高11ES細胞的轉基因效率。實驗的主要內容包括：首先在飼養(yǎng)層上建立hES細胞的培養(yǎng)體系。準備鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)，制各適合人ES細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。將hES細胞接種于飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，傳代擴增、凍存。其次建立hES細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系。參考Xu等的實驗方法，

3、接種hES細胞到預鋪細胞外基質(Matrigel)的六孔板上，加入MEFs預處理的條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系可使IlES細胞長期保持未分化狀態(tài)，并且不會改變hES細胞原有的生物學特性，其凍存與復蘇的效果與飼養(yǎng)層培養(yǎng)法無差別。因此，該培養(yǎng)體系可用于培養(yǎng)hIES細胞，并為hEs細胞轉基因研究及大規(guī)模培養(yǎng)奠定了良好的基礎。再次，由于不同啟動子調控下的綠色熒光蛋白基因在轉染hIES細胞后，報告基因的表達存在明顯的差異，因此需要比較并選

4、擇在人ES細胞中具有較高調節(jié)活性的啟動子。我們利用增強型綠色熒光蛋白(enhancexlgreenfluorescentproteinEGFP)報告基因，比較多肽延長因子(elongationfactorlaEFl∞啟動子和巨細胞病毒CMV(cytomegalovinls，CMV)啟動子在人ES細胞中的活性。結果顯示，在liES細胞中EFla啟動子活性較ClvIV啟動子強。因此，在后續(xù)實驗中我們均采用EFIa啟動予進行研究。基因轉染所需

5、的Fugene6轉染試劑具有毒性小、操作簡便、快捷的優(yōu)點，因此我們利用Fugene6將構建好的含有EFla啟動子和EGFP的質粒轉入hES細胞，瞬時轉染效率約38％：采用離心的方法，瞬時轉染效率可達到3040％。為了進一步提高轉染效率，我們決定在hES細胞中引入EBV載體系統(tǒng)。我們采用兩步法建立這一系統(tǒng)：首先，我們采用Fugene6轉染試劑將EBNAI基因穩(wěn)定轉染hES細胞，建立穩(wěn)定表達EBNA1的hES細胞系：然后利用Fugene6轉