Smad2在氧糖剝奪再灌注損傷中的表達及其作用機制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β是一類普遍存在的細胞因子，在缺血性腦損傷中，TGF-β已被證實有神經(jīng)保護作用。Smad家族是TGF-β受體的下游信號轉(zhuǎn)導因子，不同Smad蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著不同的作用。Smad2作為TGF-β信號通路的始動效應(yīng)分子，其在缺血性腦血管病中的作用機制尚不完全明了。
　　 鈣離子是體內(nèi)重要的信號分子，病理情況下如氧化應(yīng)激時細胞內(nèi)鈣超載可以直接激活Caspase或其他激酶誘發(fā)

2、凋亡。既往認為高爾基體在鈣離子調(diào)節(jié)上作用較小，然而最新的研究結(jié)果表明，高爾基體同樣在維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)中有著重要作用。分泌途徑衍生鈣離子轉(zhuǎn)運ATP酶(Secretory-pathway Ca2+-ATPase，SPCA)是P型ATP酶(P-typeATPases)的一類亞家族，目前已知SPCA的編碼基因至少有兩種:ATP2C1和ATP2C2，分別編碼SPCA1和SPCA2，都定位于高爾基體且SPCA1表現(xiàn)出的活性更強。SPCA1泵控制著高爾

3、基體內(nèi)鈣離子濃度，對高爾基體內(nèi)及胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化有著重要意義。SPCA1在腦組織中高表達并伴隨著高活性。SPCA1在神經(jīng)元的發(fā)育、遷移、形態(tài)發(fā)生中起著重要作用;神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中SPCA1持續(xù)性高表達的區(qū)域如海馬、皮質(zhì)、小腦恰好是對缺血最敏感的部位，以上均提示SPCA1在維持高爾基體功能和在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要性。目前SPCA1的研究多局限在皮膚病，關(guān)于其在腦缺血性疾病中的作用研究很少。TGF-β可以通過下調(diào)胞內(nèi)鈣離子濃度達到保護細

4、胞的作用，Smad2對于SPCA1的表達及功能是否有影響，國內(nèi)外尚無研究。
　　 死亡相關(guān)蛋白激酶(Death-as-sociating protein kinase，DAPK1)是一類鈣離子/鈣調(diào)素依賴激酶，目前認為DAPK1的主要生物學作用是參與細胞凋亡過程，在各種不同刺激下?lián)蔚蛲稣蛘{(diào)節(jié)者的作用。
　　 DAPK1與神經(jīng)細胞的死亡密切相關(guān)，有研究表明低氧-缺血損傷動物模型中其活性升高，而DAPK1的抑制劑可以減輕

5、缺血性腦損傷帶來的打擊，因此關(guān)于DAPK1在腦缺血再灌損傷中的作用正在成為目前的研究熱點和藥物靶點，但是國內(nèi)的系統(tǒng)研究尚較少。Jang等發(fā)現(xiàn)TGF-β通過Smad2～4激活DAPK1的啟動子而誘導其表達，進而促進細胞的凋亡。但是這一途徑在神經(jīng)細胞中是否立還未經(jīng)證實。
　　 本研究的目的旨在探索Smad2蛋白在腦缺血再灌損傷中的作用，是否與調(diào)節(jié)高爾基體鈣泵SPCA1的功能和DAPK1相關(guān)，探討Smad2可能的神經(jīng)保護機制。

6、　　 研究方法:
　　 1.培養(yǎng)小鼠神經(jīng)細胞瘤N2a細胞，建立氧糖剝奪再灌注模型，并采用MTT法、酶學檢查、光學顯微鏡評價氧糖剝奪模型;
　　 2.實驗分為正常對照組、普通OGD/R組、藥物干預(yù)后OGD/R組，其中普通OGD/R組、藥物干預(yù)后OGD/R組按時間點不同分為1h、4h、6h三個亞組。干預(yù)藥物為Smad2磷酸化抑制劑SB431542，特異性阻斷Smad2活化。
　　 3.流式細胞儀測定各組中細胞內(nèi)鈣離

7、子濃度的變化以及凋亡率的變化。
　　 4.Western blot檢測各組中Smad2，p Smad2，SPCA1，DAPK1的蛋白表達變化。
　　 5.QRT-PCR檢測Smad2，SPCA1，DAPK1的基因表達水平變化。
　　 6.酶學法測定各組中SPCA1活性的變化。
　　 7.免疫熒光共聚焦方法觀察SPCA1的細胞亞定位。
　　 結(jié)果:
　　 1.氧糖剝奪后細胞形態(tài)變化、LDH釋

8、放量、MTT檢測顯示:隨著氧糖剝奪時間延長，小鼠N2a細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，MTT吸光度值逐漸降低，培養(yǎng)液中LDH釋放逐漸增加;氧糖剝奪/再灌注組均較同時間點氧糖剝奪組細胞形態(tài)變化明顯，LDH釋放量更大，MTT吸光度值更低(P＜0.05)，表明再灌注過程進一步降低了細胞活性，加重了細胞損傷;
　　 2.細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化:在經(jīng)歷氧糖剝奪/再灌注后，各組細胞內(nèi)游離鈣離子濃度均較正常組明顯升高(P＜0.05)，說明OGD/R

9、誘導了細胞內(nèi)鈣超載。鈣超載的程度與OGD持續(xù)時間相關(guān)，4h時間點的鈣離子濃度值為各時間點亞組中的最高值(P＜0.01)。相同氧糖剝奪/再灌注時間點，藥物干預(yù)組的鈣超載效應(yīng)更明顯(P＜0.05)。
　　 3.SPCA1活性的變化:在氧糖剝奪再灌注后，細胞SPCA1的酶活性較正常組顯著下降(P＜0.05)，且下降程度與OGD持續(xù)時間相關(guān)。相同OGD時間點下，藥物干預(yù)后的OGD/R組酶活性較未干預(yù)組更低(P＜0.05)。在普通OGD/

10、R組，三個時間點之間OGD6h/R組的酶活性最低(P＜0.05);在藥物干預(yù)后的OGD/R組，酶活性最低值出現(xiàn)在OGD4h/R組(P＜0.05)。經(jīng)相關(guān)分析表明，鈣離子濃度的變化與SPCA1酶活性的變化呈顯著負相關(guān)(r=-0.722，P＜0.01)。
　　 4.免疫熒光共聚焦結(jié)果:標記SPCA1的紅色免疫熒光與標記GM130的綠色免疫熒光發(fā)生了明顯重疊。說明SPCA1定位于高爾基體。
　　 5.Smad2的蛋白和基因表達

11、變化:經(jīng)歷OGD/R之后，各組的Smad2的蛋白和基因表達水平均高于正常組，且與OGD的持續(xù)時間相關(guān)，說明氧糖剝奪再灌注能上調(diào)Smad2的表達。在普通OGD/R組中，4h時間點Smad2的蛋白和基因表達水平為峰值(P＜0.05);磷酸化pSmad2的表達趨勢與Smad2一致。在藥物干預(yù)后，各時間點的Smad2蛋白表達均出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，表明藥物成功抑制了磷酸化pSmad2的表達，從而使總Smad2的蛋白水平下降;同時在基因水

12、平也出現(xiàn)了有趣的變化，1h時間點Smad2的表達水平要高于普通OGD/R組，而4h及6h時間點Smad2的表達水平卻低于普通OGD/R組，6h時間點的蛋白和基因表達水平為最低值(P＜0.05)。
　　 6.SPCA1的蛋白和基因表達變化:氧糖剝奪再灌注之后，SPCA1的蛋白和mRNA水平較正常組明顯下降(P＜0.05)，與OGD持續(xù)時間呈相關(guān)性。在普通OGD/R組，1h和4h時間點的SPCA1蛋白呈持續(xù)低表達水平，6h時間點表達

13、出現(xiàn)上調(diào)(P＜0.05);藥物干預(yù)后的OGD/R組也出現(xiàn)了同樣的趨勢(P＜0.01)。mRNA的變化趨勢與蛋白水平一致。我們進一步比較了同時間點下抑制Smad2的活性對于SPCA1表達的影響。我們發(fā)現(xiàn)，只有在6h時間點，兩組出現(xiàn)了表達差異，藥物干預(yù)組的SPCA1蛋白和基因表達水平較普通OGD/R組升高(P＜0.05)。
　　 7.DAPK1的蛋白和基因表達變化:氧糖剝奪再灌注之后，DAPK1的蛋白和基因表達水平較正常組上調(diào)(P＜

14、0.05);且與氧糖剝奪的持續(xù)時間相關(guān)。4h時間點的表達水平最高(P＜0.05)。藥物阻斷Smad2活化使DAPK1的表達進一步上調(diào)(P＜0.05)。
　　 8.細胞凋亡率的變化:氧糖剝奪再灌注過程誘發(fā)了細胞的凋亡，與正常對照組有明顯差異(P＜0.05);凋亡率與OGD的持續(xù)時間相關(guān)，4h組的凋亡率最高(P＜0.01)。藥物干預(yù)使凋亡率較同時間點普通OGD/R組明顯上升(P＜0.05)，說明阻斷Smad2的活化加重了細胞的凋亡損

15、傷。
　　 結(jié)論:
　　 1.Smad2的表達水平受氧糖剝奪再灌注的調(diào)節(jié)。阻斷Smad2的活化加重了細胞內(nèi)鈣超載的程度和凋亡率;Smad2有神經(jīng)保護作用。
　　 2.氧糖剝奪再灌注抑制SPCA1的功能活性，下調(diào)蛋白和基因表達水平。SPCA1功能受損參與導致了細胞內(nèi)鈣超載;
　　 3.DAPK1的表達水平受氧糖剝奪再灌注的調(diào)節(jié);
　　 4.Smad2在氧糖剝奪再灌注中的作用與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)密切