補(bǔ)陽還五湯對(duì)rBMECs氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、廣糊中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原刨性聲明本人鄭重聲踢：所星交的學(xué)位論文，是個(gè)人在器師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工終所取得的成果。滁文中已經(jīng)特別艦以注明弓|孀的內(nèi)容外，本論文不含任簿其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作晶成果。對(duì)涔文的研究微也羹要貢獻(xiàn)髓個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。零入競壘意識(shí)魏本聲明豹法德熊累由本人承掇。學(xué)德論文作者簽名蛐網(wǎng)勰：—陽≯善籀落露V≥嗣關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本入完全了解廣州中朦莼大攀有關(guān)保翅使用孥挺論文麴

2、規(guī)定，圍意學(xué)校僳餮或囪蓬家有關(guān)部門祝掏送交論文的復(fù)幫傳和電予舨，允許被查褥鞫借潮。零入授權(quán)廣刪中醫(yī)莼太學(xué)霹戳將本學(xué)位論文豹全部或部分侮客編入有關(guān)數(shù)據(jù)霹迸行檢索，可以采藤影印、縮印或其他復(fù)印乎段保存和匯編零學(xué)位論文。(保密論文在解密盾泣遵守此規(guī)定)論文佟名j豎妙在倒置顯微鏡下觀察氧糖剝奪再灌注處理后rBMECs的形態(tài)學(xué)變化。并采用CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值、臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)各組細(xì)胞的死亡率。3補(bǔ)陽還五湯安全濃度的確定將rBMECs分

3、為對(duì)照組、模型組、補(bǔ)陽還五湯給藥組，其中補(bǔ)陽還五湯給藥組設(shè)置4個(gè)劑量，分別是1嵋mL～，10ggmLl，100btgmL～，1000燼mL～，CCK8法檢測(cè)補(bǔ)陽還五湯對(duì)rBMECs的有效濃度和安全濃度。4血腦屏障通透性檢測(cè)按照安全濃度的篩選，將rBMECs分為正常對(duì)照組、氧糖剝奪再灌注處理組、補(bǔ)陽還五湯低劑量(10ggmL‘1)和高劑量(100ggmL“1)處理組。各組作相應(yīng)處理后收集Transwell小室兩側(cè)的液體，熒光分光光度計(jì)測(cè)定

4、吸光度，計(jì)算各組的BSA透過率，以此確定氧糖剝奪再灌注處理對(duì)血腦屏障模型的損傷程度以及補(bǔ)陽還五湯是否對(duì)其具有保護(hù)作用。5Westernblot檢測(cè)Occludin及ZO1蛋白水平將rBMECs分為正常對(duì)照組、氧糖剝奪再灌注處理組、補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯高劑量組，提取各組rBⅧCs的總蛋白，采用蛋白免疫印跡法來檢測(cè)蛋白中Occludin、ZO1的量，探討氧糖剝奪再灌注處理以及補(bǔ)陽還五湯對(duì)體外血腦屏障模型緊密連接蛋白表達(dá)的影響。6熒

5、光定量RTPCR檢測(cè)Occludin及ZO1蛋白mRNA的表達(dá)水平將rBMECs分為正常對(duì)照組、氧糖剝奪再灌注處理組、補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯高劑量組，分別提取各組rBMECs的總RNA，采用熒光定量RTPCR法檢測(cè)其緊密連接蛋白Occludin、ZO1mRNA的表達(dá)水平。7CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖將rBMECs分為正常對(duì)照組、氧糖剝奪再灌注組、補(bǔ)陽還五湯低劑量組、補(bǔ)陽還五湯高劑量組，用CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，研究補(bǔ)陽還五

6、湯對(duì)氧糖剝奪再灌注細(xì)胞的促增殖作用。8BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖接種細(xì)胞爬片，將爬片分為正常組、模型組、補(bǔ)陽還五湯高、低劑量組，并對(duì)相應(yīng)組別進(jìn)行氧糖剝奪處理。采用BrdU摻入試驗(yàn)，在復(fù)氧糖時(shí)更換含有BrdU及補(bǔ)陽還五湯藥物的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后將細(xì)胞爬片進(jìn)行BrdU免疫熒光染色，觀測(cè)rBMECs的增殖狀況，并計(jì)算BrdU標(biāo)記指數(shù)。9流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期將rBMECs接種于培養(yǎng)皿中，分為正常組、氧糖剝奪再灌注處理組、補(bǔ)陽還