補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合MSCs移植對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷模型VEGF和Ki-67表達(dá)的影響.pdf

1、　　目的：采用 Zea-Longa 線栓法并加以改進(jìn)建立局灶性腦缺血再灌注模型,從頸動(dòng)脈注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),并給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯,應(yīng)用免疫組化染色法觀察大鼠缺血再灌注模型缺血側(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和增值細(xì)胞核抗原(Ki-67)的表達(dá)。來(lái)評(píng)價(jià)補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合MSCs移植對(duì)修復(fù)腦缺血再灌注損傷模型大鼠血管及病變組織的作用,來(lái)探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　方法：清

2、潔級(jí)成年健康 SD 大鼠,無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨,DMEM 培養(yǎng)液沖出骨髓,200 目鋼網(wǎng)過(guò)濾。然后用密度梯度離心法分離獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs),PBS洗兩次,將沉淀物加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液 10ml,輕輕吹打,做成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),稀釋,按設(shè)計(jì)密度接種于 T-75培養(yǎng)瓶中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底后用 25%胰蛋白酶消化傳代

3、,取第七代凍存移植。
　　采用“線栓法”制備 SD 大鼠短暫性腦缺血再灌注損傷模型,模型分為空白組、對(duì)照組、MSCs移植治療組和益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組,每組15只。在造模缺血2小時(shí)再灌注1天后,取各組造模成功的不同給藥：益氣活血方聯(lián)合MSCs 移植治療組和 MSCs 移植治療組經(jīng)頸動(dòng)脈注入 MSCs 懸液,空白組、對(duì)照組經(jīng)頸動(dòng)脈注入等量生理鹽水。腦缺血模型空白組、對(duì)照組和 MSCs移植組分別灌胃生理鹽水(15ml/k

4、g體重),聯(lián)合組按同等的相應(yīng)藥量灌服益氣活血湯藥。各組在造模前3天開(kāi)始給藥,每日一次,連用7天。結(jié)束后斷頭取腦,取缺血再灌注損傷病灶處腦組織放入固定液中固定1h,脫水、透明、浸蠟,在海馬周?chē)B續(xù)制作腦部冠狀切片。
　　應(yīng)用 HE 染色觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)；應(yīng)用免疫組化染色法識(shí)別血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和增值細(xì)胞核抗原(Ki-67)的表達(dá),光鏡下記數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1. HE 染色結(jié)果：假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞

5、結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,核呈圓形或橢圓形,核和核仁明顯,胞漿無(wú)紅染,無(wú)細(xì)胞及間質(zhì)水腫；模型組和移植組鏡下見(jiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、胞體皺縮,核固縮、碎裂、溶解,胞漿濃縮紅染,間質(zhì)水腫明顯,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；聯(lián)合組神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死數(shù)量減少與程度明顯減輕。
　　2. 空白組腦組織中VEGF幾乎不表達(dá),對(duì)照組、MSCs移植治療組和益氣活血方聯(lián)合MSCs治療組與空白組相比,數(shù)目明顯增多,尤以益氣活血方聯(lián)合MSCs治療組表達(dá)最強(qiáng)。MSCs移植治療組

6、與對(duì)照比較P<0.05,益氣活血方聯(lián)合MSCs 治療組與對(duì)照組比較 P<0.01；益氣活血方聯(lián)合 MSCs 治療組與 MSCs 移植治療組比較P<0.05。
　　3. 空白組腦組織中 Ki-67幾乎不表達(dá),對(duì)照組、MSCs 移植治療組和益氣活血方聯(lián)合 MSCs 治療組均可見(jiàn)到 Ki-67 表達(dá),MSCs 移植治療組與對(duì)照組比較 P<0.05,益氣活血方聯(lián)合 MSCs 治療組與對(duì)照組比較 P<0.01；益氣活血方聯(lián)合MSCs治療

7、組與MSCs移植治療組比較P<0.05。
　　結(jié)論：
　　1. 采用密度梯度離心法獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( MSCs),將細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)使細(xì)胞得到擴(kuò)增和純化的MSCs。
　　2. 短暫性腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的制備采用改良線栓法取得了較好效果,神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分理想,癥狀很接近人表現(xiàn)。其簡(jiǎn)便、易行,容易操作,很具有實(shí)用性,是制作腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型理想的方法。
　　3. 應(yīng)用免疫組化染色法證明了