脈沖磁場和補陽還五湯對腦缺血再灌注大鼠IGF-1表達影響的研究.pdf

1、研究背景： 近年來，對磁場的生物學(xué)效應(yīng)及治療作用進行了深入的研究，磁場對腦損傷性疾病的影響研究已成為一個熱點。動物實驗和臨床研究均證實磁刺激對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，有助于改善急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損。本課題設(shè)計利用磁場干預(yù)大鼠腦缺血再灌注模型，探討磁場對腦缺血大鼠腦內(nèi)IGF-1表達的影響以及對神經(jīng)功能缺失、腦缺血梗死面積、缺血后病理組織學(xué)的影響，為磁場的神經(jīng)保護作用提供實驗室基礎(chǔ)。 補陽還五湯(BYHWD)始載

2、于《醫(yī)林改錯》，由清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，以補氣藥與活血祛瘀藥相配伍，以益氣固攝為主，化瘀通絡(luò)為輔，具有補氣活血，通經(jīng)活絡(luò)的功效，是治療氣虛血瘀型腦缺血疾病的名方。本文利用BYHWD灌注腦缺血再灌注大鼠，觀察BYHWD對IGF-1表達的影響以及BYHWD對神經(jīng)功能缺失、腦缺血梗死面積、缺血后病理組織學(xué)的影響，以期發(fā)現(xiàn)BYHWD與IGF-1在神經(jīng)修復(fù)方面有無內(nèi)在關(guān)系，為BYHWD的神經(jīng)保護作用提供新的實驗室基礎(chǔ)。 目的：觀察腦缺血再灌

3、注后時間與IGF-1表達的關(guān)系，研究磁場、BYHWD對腦缺血再灌注大鼠IGF-1表達的影響，為磁場、BYHWD的腦保護作用提供實驗室依據(jù)。 設(shè)計：完全隨機設(shè)計。 方法： 1.40只SpragueDawley(SD)大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注后2h組、1d組、3d組和7d組，每組8只。2h組、1d組、3d組、7d組用線栓法阻斷右側(cè)大腦中動脈供血，2h后撥出線栓恢復(fù)大腦中動脈供血制成右側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)模

4、型，假手術(shù)組僅做右側(cè)頸外動脈和頸總動脈結(jié)扎，不做右側(cè)大腦中動脈線栓栓塞。參照ZealLonga5分法進行評分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。評分1～4分為造模成功。32只大鼠造模成功。各組動物分別在造模后0h(假手術(shù)組)、2h、1d、3d、7d處死

5、，斷頭取腦。主要觀察指標(biāo)：用免疫組化法(IHC)觀察各組梗死區(qū)IGF-1的表達。 2.80只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、脈沖磁場組、BYHWD組、脈沖磁場聯(lián)合BYHWD組(聯(lián)合組)，每組16只，模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組制作右側(cè)MCAO模型，假手術(shù)組僅做右側(cè)頸外動脈和頸總動脈結(jié)扎，不做右側(cè)大腦中動脈線栓栓塞。脈沖磁場組和聯(lián)合組于造模結(jié)束后開始用脈沖磁療儀進行干預(yù)，異名磁極對置于大鼠頭部，磁距為7～10cm，磁場強

6、度為0～0.01T，頻率為50HZ，20min／次，每天1次，連續(xù)7d；BYHWD組和聯(lián)合組予灌服BYHWD水煎液，按生藥13.3g／kg灌胃，連續(xù)給藥7d；假手術(shù)組和模型組不作磁場處理及BYHWD灌胃處理。7d后處死各組大鼠，斷頭取腦。主要觀察指標(biāo)：①分別在2h、1d、3d、7d進行神經(jīng)功能缺失評分；②采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察梗死面積大小；③蘇木素-伊紅染色(HE)觀察病理組織學(xué)改變；④IHC檢測IGF-1的

7、表達。 結(jié)果：120只大鼠進入結(jié)果分析。 1.腦缺血再灌注大鼠IGF-1的表達 采用單因素方差分析的檢驗方法，組間多重比較采用LSD檢驗，組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=60.867，P=0.000)。經(jīng)組間多重比較顯示：IGF-1在假手術(shù)組神經(jīng)細胞中表達最弱，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注后2h組、1d組、3d組、7d組梗死區(qū)陽性細胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；與2h組、1d組相比，3d組陽性細胞數(shù)增多，

8、其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；與3d組相比，7d組陽性細胞數(shù)有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；與1d組相比，7d組陽性細胞數(shù)無顯著性差異(P=0.712)，但與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。 2.脈沖磁場、BYHWD對腦缺血再灌注大鼠IGF-1表達的影響 2.12h、1d、3d、7d神經(jīng)功能缺失評分 采用重復(fù)測量的檢驗方法，時間因素不同水平組間多重比較及固定時間因素后不同實

9、驗分組間的多重比較均采用LSD方法。 假手術(shù)組在2h、1d、3d、7d時神經(jīng)功能缺失評分均為0分。模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組各組間比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=5.479，P=0.032)，神經(jīng)功能缺失評分在不同的時間之間有顯著差異(F=106.922，P=0.000)，組別與時間有交互效應(yīng)(F=3.867，P=0.000)。從3d開始，各組神經(jīng)功能缺失評分隨時間的延長呈逐漸下降趨勢：從時間點來看，2h和1d時模型組、脈

10、沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組的評分無顯著差異(F=0.760，P=0.521和F=1.538，P=0.214)；3d時模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組的評分有顯著差異(F=12.612，P=0.000)，BYHWD組、脈沖磁場組和聯(lián)合組的評分低于模型組，聯(lián)合組的評分低于BYHWD組、脈沖磁場組；7d時模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組的評分有顯著差異(F=4.609，P=0.002)，脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組評分

11、均低于模型組，脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組評分無顯著性差異 2.2腦組織TTC染色結(jié)果 腦梗死面積百分數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗。假手術(shù)組腦組織切片均紅染，無白色梗死灶。模型組大鼠梗死灶位于缺血側(cè)腦組織額頂部外側(cè)皮層，腦梗死灶明顯，梗死區(qū)內(nèi)壞死組織呈蒼白色，未壞死組織呈玫瑰紅色。各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.383，P=0.000)。經(jīng)組間多重比較顯示：與模型組相比，脈沖磁場組、B

12、YHWD組、聯(lián)合組梗死面積均減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。與脈沖磁場組相比，BYHWD組梗死面積差異沒有顯著性意義(P=0.552)。聯(lián)合組與脈沖磁場組和BYHWD組相比，梗死面積減小，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009，P=0.035)。 2.3腦組織切片HE染色結(jié)果 假手術(shù)組：神經(jīng)細胞數(shù)目多，形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，細胞排列規(guī)整。核深染，核膜清晰，核仁明顯。高倍鏡下可見神經(jīng)元細胞胞漿豐富，呈灰藍色斑塊狀，表明尼氏體

13、豐富。 模型組：壞死區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，組織染色變淺，組織結(jié)構(gòu)疏松，膠質(zhì)細胞增生，部分神經(jīng)元細胞核固縮，胞體縮小變形，殘留的神經(jīng)元細胞周圍間隙增寬，神經(jīng)元細胞正常形態(tài)消失，胞質(zhì)紅染、均勻，可見鬼影細胞。邊緣區(qū)低倍鏡下可見較多形態(tài)大致正常的神經(jīng)元細胞，膠質(zhì)細胞無明顯增生，組織顏色較深。在高倍鏡下可見邊緣區(qū)部分神經(jīng)元細胞漿染色呈淡染，尼氏小體消失，并可見神經(jīng)元細胞核固縮。 脈沖磁場組：壞死區(qū)膠質(zhì)細胞較模型組增生明顯，形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)，出

14、現(xiàn)噬神經(jīng)現(xiàn)象，仍可見較完整的紅色神經(jīng)元細胞，個別神經(jīng)元細胞核固縮，胞體縮小變形。邊緣區(qū)在高倍鏡下可見邊緣區(qū)神經(jīng)元細胞胞漿藍染，呈顆粒狀，尼氏體豐富。神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)整，核深染，核仁清。 BYHWD組：壞死區(qū)膠質(zhì)細胞較模型組增生明顯，有膠質(zhì)結(jié)節(jié)形成，可見較完整的紅色神經(jīng)元細胞，個別神經(jīng)元細胞核固縮，胞體縮小變形。高倍鏡下可見邊緣區(qū)神經(jīng)元細胞胞漿藍染，顆粒狀，尼氏體較豐富，神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)整，核深染，核仁清。 聯(lián)合組：壞死區(qū)膠質(zhì)

15、細胞較模型組增生明顯，可見完整的紅色神經(jīng)元細胞。高倍鏡下可見邊緣區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)規(guī)整，核深染，核仁清，神經(jīng)元細胞胞漿藍染明顯，呈顆粒狀，尼氏體豐富。 2.4脈沖磁場和BYHWD干預(yù)后IGF-1的表達結(jié)果 脈沖磁場與BYHWD干預(yù)后IGF-1陽性細胞數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗。各組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=592.714，P=0.000)。經(jīng)組間多重比較顯示，IGF-1陽性細胞數(shù)在假手術(shù)組最少

16、；與假手術(shù)組相比，模型組缺血再灌注7d后缺血梗死側(cè)大腦皮層IGF-1陽性細胞數(shù)增多，差異有顯著性意義(P=0.007)；與假手術(shù)組和模型組相比，BYHWD組缺血再灌注7d后IGF-1陽性細胞數(shù)增多，差異有顯著性意義(P=0.000)；與假手術(shù)組、模型組和BYHWD組相比，脈沖磁場組陽性細胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與假手術(shù)組、模型組、脈沖磁場組和BYHWD組相比，聯(lián)合組再灌注7d后IGF-1陽性細胞數(shù)增多，差異有顯著性意義(P=0.00

17、0)。 結(jié)論：正常情況下腦組織中僅有少量IGF-1表達，腦缺血再灌注發(fā)生后，腦中IGF-1的自分泌即啟動，再灌注3d后IGF-1的表達達到高峰，7d缺血側(cè)大腦皮層IGF-1的表達有所下降，但仍明顯高于假手術(shù)組。這表明腦缺血再灌注可促進內(nèi)源性IGF-1的分泌，有助于缺血狀態(tài)下神經(jīng)組織的自我保護和修復(fù)，但這種促分泌作用維持時間不長。脈沖磁場和BYHWD干預(yù)后缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分改善明顯、腦梗死面積減小，神經(jīng)系統(tǒng)的保護和修復(fù)作用