IGF-1對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF、bFGF表達(dá)的影響及意義.pdf

1、缺血性腦血管病是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，具有很高的致死率和致殘率。與心臟病、惡性腫瘤一起，構(gòu)成了多數(shù)國家的三大致殘疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。如何改善缺血性腦損傷后腦血流、促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)與再生，一直是人們研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，神經(jīng)生長因子和血管生長因子更是倍受關(guān)注。目前研究較多的是胰島素樣生長因子-1(Insulin like growth factor-1，IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial

2、 growth factor,VEGF)和堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)等。隨著研究的不斷深入，外源性IGF-1已開始應(yīng)用于缺血性腦血管病的實(shí)驗(yàn)研究，但腦缺血后IGF-1和VEGF、bFGF表達(dá)的關(guān)系，以及IGF-1發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)保護(hù)作用的確切機(jī)制，目前為止，尚不清楚。 目的：通過線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后局灶性腦缺血再灌注模型。經(jīng)側(cè)腦室注射胰島素樣生長因子(IGF

3、-1)后，采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)，觀察IGF-1對(duì)大鼠腦組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)蛋白和基因表達(dá)的影響，初步探討IGF-1對(duì)腦缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制，為IGF-1進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為腦梗死的治療提供新途徑。 方法： 1、采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后局灶性腦缺血再灌注模型。 2、動(dòng)物分組：取健康成年SD大鼠72只，體重250～300g，雌雄

4、不限，隨機(jī)分為3組：(1)假手術(shù)組(n=24)；(2)腦缺血/再灌注組(n=24)；(3)IGF-1治療組(n=24)。腦缺血/再灌注組、IGF-1治療組再隨機(jī)分為缺血2h再灌注12 h、1d、3d、7d四個(gè)亞組，每亞組6只。假手術(shù)組也按相同的時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為四個(gè)亞組，每亞組6只。IGF-1治療組大鼠局灶性腦缺血/再灌注(MCAO)模型制備成功后，即刻在立體定向儀下向大鼠左側(cè)腦室緩慢注射IGF-1 10μL，時(shí)間不少于10min；腦缺血/

5、再灌注組用同樣方法注射0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)10μL；假手術(shù)組僅作頸部皮膚切口和血管分離，不行MCAO，但行等量PBS注射。 3、各組大鼠均在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)快速斷頭取腦。從額極到枕葉按A、B、C、D 4等份切腦，A腦片棄去，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)剝?nèi)、C腦片梗死灶周圍的腦皮層組織各100mg，在1％的DEPC水中稍作漂洗，立即放入凍存管中，液氮中保存。B腦片用于檢測(cè)VEGF-mRNA含量、C腦片用于檢測(cè)bFGF-mRNA含量，

6、均采用RT-PCR方法。D腦片放入4％多聚甲醛中固定，24h后石蠟包埋，作5μm切片，用于既染色和VEGF、bFGF的免疫組化染色。 4、行為學(xué)評(píng)價(jià)：在缺血再灌注后12h、24h、3d、7d，由不了解實(shí)驗(yàn)分組的人員采用改良神經(jīng)功能評(píng)分(Modifled neurological severity score，mNSS)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)檢查。 改良神經(jīng)功能評(píng)分從0到18分之間分級(jí)(正常為0分，最嚴(yán)重?fù)p傷18分)。1分代表不

7、能完成一項(xiàng)任務(wù)或缺少一項(xiàng)測(cè)試反射，1～6分為輕度損害，7～12分為中度損害，13～18分為重度損害。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所測(cè)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以a=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果： 1、腦缺血/再灌注組和IGF-1治療組大鼠術(shù)后出現(xiàn)左側(cè)Homer's征，右側(cè)肢體癱瘓，以前肢為重，說明MCAO模型制備成功。假手術(shù)組僅出現(xiàn)左側(cè)Homer

8、's征。 2、假手術(shù)組大鼠均無神經(jīng)功能缺損癥狀。大鼠缺血再灌注12h、24h、3d、7d行為學(xué)評(píng)分(mNSS)，IGF-1治療組均顯著低于缺血再灌注組((P<0.05)。 3、腦缺血/再灌注組半暗帶皮質(zhì)區(qū)VEGF蛋白陽性細(xì)胞數(shù)于腦缺血再灌注24h達(dá)高峰，3d降至較低水平，7d降至基線水平。IGF-1治療組VEGF 蛋白表達(dá)于缺血再灌注12h到7d較腦缺血/再灌注組顯著增高，p<0.05。 4、VEGF mRNA表

9、達(dá)以12h表達(dá)最高，持續(xù)至24h很快降低，7d降至較低水平。IGF-1治療組VEGF mRNA表達(dá)，在各時(shí)間點(diǎn)均高于腦缺血/再灌注組，p<0.05。 5、腦缺血/再灌注組bFGF蛋白陽性細(xì)胞數(shù)于24h達(dá)高峰，然后逐漸降低，7d仍有少量表達(dá)；IGF-1治療組各時(shí)間點(diǎn)bFGF蛋白表達(dá)均較腦缺血/再灌注組高，P<0.05。 6、bFGF mRNA 12h表達(dá)水平最高，后逐漸降低，7d降到較低水平。IGF-1治療組與腦缺血/再灌

10、注組比較，各時(shí)間點(diǎn)bFGF mRNA表達(dá)均較同時(shí)間點(diǎn)高，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 7、HE染色，光鏡下觀察，假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)無明顯異常。缺血再灌注24 h正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)減少明顯，神經(jīng)元空泡變性多，可見細(xì)胞核固縮，組織疏松，細(xì)胞間隙增大。IGF-1治療組腦組織損傷程度較輕，皮層神經(jīng)元細(xì)胞空泡變性較少，間質(zhì)水腫輕，正常細(xì)胞數(shù)增多。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)通過側(cè)腦室注入外源性IGF-1，明顯改善了大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能

11、，證明IGF-1對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。 2、腦缺血后可誘導(dǎo)VEGF、bFGF基因及蛋白表達(dá)增高，是自我保護(hù)機(jī)制的一種反應(yīng)。 3、IGF-1可以使腦缺血再灌注后腦組織中VEGF、bFGF的表達(dá)進(jìn)一步增高。 4、IGF-1對(duì)腦缺血的保護(hù)作用可能是通過增加腦組織中VEGF、bFGF基因及蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。 5、本實(shí)驗(yàn)探討了IGF-1對(duì)腦缺血的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用IGF-1治療腦缺血損傷提供了理論