PAQR3過表達對氧糖剝奪再灌注損傷的保護作用及其可能機制.pdf

1、第一章，氧糖剝奪再灌注后高爾基體蛋白PAQR3的表達變化
　　目的:
　　探討氧糖剝奪再灌注后細胞形態(tài)、細胞活性、細胞凋亡以及高爾基體蛋白PAQR3的表達變化。
　　方法:
　　以小鼠來源神經(jīng)瘤母細胞N2a細胞為研究對象，經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞活性，流式雙染法檢測細胞凋亡，并應(yīng)用Real-time PCR和Western blot技術(shù)分別檢測PAQR3的mRNA和蛋

2、白表達。
　　結(jié)果:
　　1.細胞形態(tài)的變化:氧糖剝奪4小時再灌注12小時及24小時后，細胞形態(tài)明顯受損，貼壁能力減弱，細胞之間的間隙增大，折光性降低，胞體輪廓模糊，突起減少或消失，細胞縮小變圓，部分死亡崩解的細胞抱團懸浮于培養(yǎng)液中。
　　2.細胞活性的變化:與正常組比較，氧糖剝奪4小時再灌注0小時和4小時細胞活性出現(xiàn)下降，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而再灌注12小時和24小時，與正常組比較，細胞活性明顯下

3、降(P＜0.05)。
　　3.細胞凋亡率的變化:氧糖剝奪4小時再灌注4小時、12小時和24小時，細胞的凋亡率明顯增高，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.PAQR3 mRNA的表達變化:與正常組相比，氧糖剝奪4小時再灌注0小時與4小時PAQR3 mRNA的表達明顯減少(P＜0.05);再灌注12小時和24小時，PAQR3的mRNA表達進一步減少，與正常組比較，具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。

4、r>　　5.PAQR3的蛋白表達變化:與正常組相比，氧糖剝奪4小時再灌注0小時，PAQR3的蛋白表達稍有減少，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而再灌注4小時、12小時和24小時，PAQR3的蛋白表達明顯減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.氧糖剝奪再灌注導(dǎo)致細胞形態(tài)受損、活性下降，誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　2.氧糖剝奪再灌注下調(diào)高爾基體蛋白PAQR3的表達。
　　第二章，小鼠PAQR3真核表達載體的構(gòu)建及

5、表達
　　目的:
　　構(gòu)建小鼠PAQR3真核表達質(zhì)粒并驗證其在N2a細胞中的表達。
　　方法:
　　從Genebank找到小鼠PAQR3基因全長序列，通過人工化學(xué)合成，裝載于表達載體CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，大量擴增后進行PCR鑒定和測序證實其正確性。將鑒定正確的重組質(zhì)粒利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染N2a細胞，并采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率、MTT法評估PAQR3過表達對N2a細胞生長曲線的影響、R

6、eal-time PCR和Western blot技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后細胞中PAQR3的基因和蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建了小鼠PAQR3真核表達質(zhì)粒，并利用脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染N2a細胞，經(jīng)熒光顯微鏡檢測，轉(zhuǎn)染后72小時轉(zhuǎn)染效率最高;MTT法檢測顯示，與正常細胞和空載體轉(zhuǎn)染細胞相比，PAQR3過表達對N2a細胞的生長曲線無明顯影響;Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測顯示轉(zhuǎn)染細胞株中PAQR3

7、的基因和蛋白明顯高表達。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建小鼠PAQR3真核表達質(zhì)粒并在N2a細胞中高表達。
　　第三章，PAQR3過表達對氧糖剝奪再灌注損傷的保護作用及其可能機制
　　目的:
　　研究PAQR3過表達在氧糖剝奪再灌注損傷中的作用并探討其可能機制。
　　方法:
　　將構(gòu)建成功的PAQR3真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細胞，經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞活性

8、，流式雙染法檢測細胞凋亡率的變化;選取細胞形態(tài)、活性、凋亡率變化最顯著的時間點，應(yīng)用Real-time PCR檢測ERK1、ERK2和AKT的mRNA表達;Western blot技術(shù)檢測PAQR3、ERK1/2、AKT、GSK3β和對應(yīng)的磷酸化蛋白p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，經(jīng)氧糖剝奪4

9、小時再灌注12及24小時后，與空載體組相比，細胞形態(tài)受損明顯減輕，細胞活性增高(P＜0.05)，凋亡率下降(P＜0.01)。
　　2.PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，經(jīng)氧糖剝奪4小時再灌注12及24小時后，與空載體組相比，ERK1、ERK2和AKT的mRNA表達無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.正常細胞經(jīng)氧糖剝奪4小時再灌注24小時后，與未OGD組相比，p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表達明顯增多(P＜0.

10、05); PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，經(jīng)氧糖剝奪4小時再灌注24小時后，與空載體組相比，PAQR3穩(wěn)定高表達，p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表達顯著減少(P＜0.05)。
　　4.正常細胞經(jīng)氧糖剝奪4小時再灌注24小時后，與未OGD組相比，p-AKT(Ser473)的表達顯著增多(P＜0.05)，p-GSK3β(Ser9)的表達顯著減少(P＜0.05); PAQR3真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，經(jīng)氧糖剝奪4小時再灌注24