FEZ1在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣，在形態(tài)、受體的分布及胞質(zhì)活性物質(zhì)的含量等方面都存在明顯的異質(zhì)性，不同譜系發(fā)生的星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所起的作用至今仍不明確。 目的： (1)分離、培養(yǎng)獲得不同譜系來源的兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞(T1A和T2A)，通過基因表達(dá)譜芯片技術(shù)構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜，進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出細(xì)胞特異性差異表達(dá)基因。 (2)從獲得的基因表達(dá)譜中，選定在膠質(zhì)細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的軸突成束和

2、延伸相關(guān)基因FEZ1，分析FEZ1在培養(yǎng)的兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)定位。 (3)分析FEZ1在大鼠腦組織發(fā)育過程中的表達(dá)變化。 (4)通過FEZ1基因克隆，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及原核表達(dá)方法，初步探討FEZ1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響。 方法： 第一部分(1)采用振蕩法和差速貼壁法，從新生一天SD大鼠大腦皮層分離獲得T1A和T2A，免疫熒光雙標(biāo)鑒定；(2)應(yīng)用BiostarR-40s基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)

3、比分析在培養(yǎng)的T1A和T2A中細(xì)胞特異性差異表達(dá)基因情況。 第二部分(1)利用半定量RT-PCR、Realtime RT-PCR、western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測(cè)FEZ1基因在T1A和T2A中的表達(dá)及細(xì)胞定位情況，驗(yàn)證基因表達(dá)譜芯片結(jié)果。(2)取生后1天、3天、7天、2周、1個(gè)月、3個(gè)月的SD大鼠，灌注后取腦進(jìn)行冰凍切片，并分別以FEZ1和GFAP或NF對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)，檢測(cè)FEZ1在腦組織

4、發(fā)育過程中的表達(dá)定位。 第三部分應(yīng)用RT-PCR方法從大鼠大腦皮層克隆獲得FEZ1全長(zhǎng)序列，構(gòu)建pEGFP-N1-FEZ1真核表達(dá)重組質(zhì)粒和FEZ1 RNAi質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，初步觀察FEZ1基因?qū)π切文z質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；構(gòu)建pET-28a-FEZ1原核表達(dá)重組質(zhì)粒，體外原核表達(dá)His-FEZ1融和蛋白，觀察FEZ1對(duì)背根節(jié)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果： (1)應(yīng)用上海博星基因芯片

5、公司星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片BiostarR-40s，四次芯片結(jié)果交集顯示，在4096個(gè)檢測(cè)點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因138條，99個(gè)為已知基因，其中42個(gè)在T1A中高表達(dá)，57個(gè)在T2A中高表達(dá)。與神經(jīng)軸突傳導(dǎo)相關(guān)基因均在T2A中表達(dá)上調(diào)，其中新發(fā)現(xiàn)的與軸突成束和延伸相關(guān)的FEZ1基因在膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及作用國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報(bào)道。 (2)RT-PCR及western blot結(jié)果顯示FEZ1在體外培養(yǎng)的兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞中mR

6、NA水平及蛋白水平均有表達(dá)，且在T2A中表達(dá)明顯增加，與基因表達(dá)譜芯片結(jié)果一致。細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，F(xiàn)EZ1蛋白在O2A祖細(xì)胞、T1A、T2A細(xì)胞中均有表達(dá)，分布于細(xì)胞胞漿及突起，在T1A及T2A中可與GFAP共定位，細(xì)胞核中沒有表達(dá)。 (3)FEZ1在大鼠腦組織嗅球的僧帽細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞，海馬CA1-3區(qū)的錐體細(xì)胞，皮層錐體細(xì)胞也有表達(dá)，嗅球及海馬齒狀回星形膠質(zhì)細(xì)胞有表達(dá)，生后7天FEZ1表達(dá)量達(dá)最高

7、。 (4)構(gòu)建的pEGFP-N1-FEZ1真核重組質(zhì)粒和FEZ1 RNAi質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞，干擾FEZ1基因表達(dá)可降低細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。 (5)構(gòu)建的pET-28a-FEZ1原核表達(dá)重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確，在BL21大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)His-FEZ1融和蛋白，該蛋白對(duì)大鼠背根節(jié)突起生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。 結(jié)論： (1)不同譜系來源的兩型星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜存在明顯差異，其

8、中與神經(jīng)軸突傳導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)差異提示T1A和T2A可能在誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)方面有不同功能。 (2)首次研究證實(shí)，F(xiàn)EZ1基因在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)譜系細(xì)胞中均有表達(dá)，但在T2A中表達(dá)明顯增加。 (3)FEZ1在大鼠腦組織發(fā)育過程中嗅球、海馬神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)。 (4)成功構(gòu)建了pEGFP-N1-FEZ1真核重組質(zhì)粒、FEZ1 RNAi質(zhì)粒以及pET-28a-FEZ1原核表達(dá)重組質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究FEZ1對(duì)星形膠