氨上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1基因的表達(dá).pdf

1、尿素循環(huán)缺陷、雷爾氏綜合征或肝功能衰竭引起的高氨血癥可以導(dǎo)致多種精神和行為異常，如神志不清、健忘、煩躁和意識(shí)改變包括昏睡、嗜睡，晚期可以由腦水腫導(dǎo)致昏迷甚至是死亡。氨在肝性腦病中的致病作用在20世紀(jì)30年代就已經(jīng)被確定，現(xiàn)在人們普遍接受特征性癥狀學(xué)由腦內(nèi)氨濃度升高到3～5mM所致。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，氨慢性處理能增強(qiáng)培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞Na+，K+-ATP酶(NKA)的活性。主要與Na，K+-ATP酶α2亞基表達(dá)增加相關(guān)，氨依賴性的內(nèi)

2、源性哇巴因復(fù)合物生成增加，哇巴因與NKA結(jié)合，激活后續(xù)的Src，EGF受體，Raf, Ras，MEK和ERK1/2信號(hào)通路。ERK1/2的磷酸化誘導(dǎo)α基因表達(dá)上調(diào)。而且，這個(gè)信號(hào)通路結(jié)果與腎細(xì)胞系中低濃度哇巴因誘導(dǎo)的信號(hào)通路幾乎相同。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞與其他非興奮性神經(jīng)細(xì)胞在形態(tài)和功能上高度不同，它們利用細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Na+濃度的動(dòng)態(tài)波動(dòng)完成它們的興奮性。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的Ca2+通道，如InsP3受體（InsP3Rs）和

3、蘭尼堿受體(RyRs)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER) Ca2+的釋放被認(rèn)為是膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca+信號(hào)的主要機(jī)制。ER內(nèi)Ca2+持續(xù)釋放，導(dǎo)致ER內(nèi)Ca+耗竭，可以激活Ca2+池操縱性細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)流(store-operated plasmalemmal Ca2+entry，SOCE)，也被稱為容量性Ca+內(nèi)流(capacitative Ca2+ entry)。同時(shí)期的研究觀點(diǎn)表明，SOCE可通過(guò)ORAI通道誘導(dǎo)鈣釋放激活的鈣電流(ICRAC)或者通

4、過(guò)細(xì)胞膜瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)陽(yáng)離子通道來(lái)介導(dǎo)。星形膠質(zhì)細(xì)胞SOCE主要和基本的組分由“經(jīng)典”的TRP通道（“canonical”TRP channels）代表;其中TRPC1，4和5在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。TRPC1亞基是通道的主要組分，因此負(fù)責(zé)通道的主要功能，而TRPC4/5是輔助亞基。用反義寡核苷酸敲除TRPC1或應(yīng)用TRPC1阻斷性抗體大大的降低星形膠質(zhì)細(xì)胞SOCE。

5、　　已經(jīng)報(bào)道用5mM氨急性處理由于氨誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)堿化增加ER內(nèi)Ca2+釋放。然而，臨床上很多藥物慢性作用均能影響星形膠質(zhì)細(xì)胞InsP3Rs誘導(dǎo)的ER內(nèi)Ca+釋放。最近，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由InsP3Rs和RyRs活化介導(dǎo)的ER內(nèi)Ca2+釋放和容量性Ca2+攝取，可以被選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑氟西汀、抗雙極抑郁藥鋰、卡馬西平和丙戊酸抑制。已經(jīng)證實(shí)，三種抗雙極抑郁藥均下調(diào)TRPC1基因的表達(dá)。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，包括

6、β1-腎上腺素能受體、Gs-偶聯(lián)受體和α2-腎上腺素能受體、Gi/o型偶聯(lián)受體。在星形膠質(zhì)細(xì)胞激活這兩種受體導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)轉(zhuǎn)激活。激活β1受體可以誘導(dǎo)PKA依賴性Gs/Gi轉(zhuǎn)換，從而，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+釋放。然而，α2A腎上腺素能受體有效和特異性激動(dòng)劑右旋美托咪啶，可以導(dǎo)致βγ亞基從Giα解離，而后者可以激活磷脂酶C。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞是肝性腦病主要的細(xì)胞基礎(chǔ)，星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的谷氨

7、酰胺合成酶是中樞氨解毒作用的主要酶。腦氨水平增高的腦谷氨酰胺合成酶的活性增強(qiáng)可以影響星形膠質(zhì)細(xì)胞主要的自身穩(wěn)態(tài)功能，包括可以導(dǎo)致異常神經(jīng)傳遞和腦水腫的K+、谷氨酸和水平衡;肝性腦病的基礎(chǔ)可以認(rèn)為是膠質(zhì)細(xì)胞的病理毒理?yè)p害。本研究中，我們主要研究病理濃度的氨對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的影響。
　　在本研究中，我們主要研究:①氨慢性處理對(duì)異丙腎上腺素和右旋美托咪啶誘導(dǎo)的Ca2+釋放的影響;②氨慢性處理對(duì)InsP3Rs和RyRs誘導(dǎo)的Ca2+

8、釋放的影響;③氨慢性處理對(duì)SOCE的影響;④氨慢性處理對(duì)TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響;⑤哇巴因抑制劑坎利酮對(duì)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氨誘導(dǎo)的TRPC1基因表達(dá)和SOCE的抑制作用;⑥注射尿素酶3天后的CD-1小鼠腦組織TRPC1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá);⑦注射尿素酶3天后特殊熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠新鮮分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞TRPC1 mRNA的表達(dá)。
　　方法:
　　氯化銨慢性作用細(xì)胞3天，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):①細(xì)胞用

9、熒光探針染料Fura-2負(fù)載，奧林巴斯活細(xì)胞熒光顯微鏡下檢測(cè)氯化銨慢性作用對(duì)β-腎上腺素受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素和α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑右旋美托咪啶刺激引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加的影響;②利用熒光探針技術(shù)，檢測(cè)氯化銨慢性作用對(duì)RyRs激動(dòng)劑4-CMC和InsP3Rs激動(dòng)劑AdA刺激引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+增加的影響;③利用熒光探針技術(shù)，檢測(cè)哇巴因抑制劑坎利酮對(duì)氯化銨慢性處理引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca+內(nèi)流增加的影響;④用RT-PC

10、R和免疫印跡方法檢測(cè)哇巴因抑制劑坎利酮對(duì)氯化銨慢性處理原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表達(dá)的影響;⑤CD-1小鼠腹腔注射尿素酶3天建立高血氨模型后，用RT-PCR和免疫印跡方法檢測(cè)尿素酶對(duì)腦組織TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表達(dá)的影響;⑥FVB/NTg(GFAP-GFP)14Mes/J或者B6.Cg-Tg(Thy1-YFPH)2Jrs/J轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射尿素酶3天建立高血氨模型后，取腦組織制備新鮮細(xì)胞懸液

11、采用流式細(xì)胞儀分離星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，用RT-PCR檢測(cè)尿素酶對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表達(dá)的影響;使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-wayANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、氯化銨慢性處理能夠增強(qiáng)異丙腎上腺素和右旋美托咪啶刺激引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度
　　β-腎上腺素受體激動(dòng)劑異

12、丙腎上腺素或者α-腎上腺素受體激動(dòng)劑右旋美托咪啶刺激后能迅速引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，氯化銨作用3天后的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予刺激后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加幅度變大，且很快恢復(fù)正常，氯化銨能明顯增加異丙腎上腺素或右旋美托咪啶刺激引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度。
　　2、氯化銨慢性處理能夠增強(qiáng)4-CMC、AdA刺激引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度
　　RyRs的激動(dòng)劑4-CMC或InsP3Rs的激動(dòng)劑AdA刺

13、激細(xì)胞后能夠引起細(xì)胞內(nèi)濃度的增加，氯化銨作用3天后能明顯增加4-CMC或AdA刺激引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度，4-CMC作用緩慢而持久，AdA作用迅速而短暫，刺激后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增加。
　　3、哇巴因抑制劑坎利酮對(duì)氯化銨慢性處理引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增加的影響
　　Thapsigargin是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+-ATP酶的抑制劑，將細(xì)胞加入Thapsigargin作用10 min，耗竭星形膠質(zhì)細(xì)

14、胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+，再重新加入CaCl2。細(xì)胞加入Thapsigargin刺激后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度短暫增加，氯化銨對(duì)此作用沒(méi)有影響。與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，當(dāng)加入CaCl2后，氯化銨慢性作用組星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)容量性Ca2+內(nèi)流幅度增加25％，哇巴因抑制劑坎利酮能夠明顯抑制氯化銨慢性作用引起的細(xì)胞內(nèi)容量性Ca2+內(nèi)流的增加，使細(xì)胞內(nèi)容量性Ca2+內(nèi)流的增加幅度恢復(fù)到正常水平。
　　4、氯化銨慢性作用上調(diào)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1m

15、RNA及TRPC1蛋白的表達(dá)，這一作用可以被哇巴因抑制劑坎利酮所抑制
　　慢性氨作用引起的鈣池操控性鈣離子內(nèi)流峰值的增加與氯化銨慢性處理3天引起特異性TRPC1蛋白和mRNA表達(dá)升高有關(guān)。原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用氯化銨作用3天后濃度依賴性使TRPC1 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，而哇巴因抑制劑坎利酮能夠明顯抑制氯化銨慢性作用引起的TRPC1 mRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)。
　　5、尿素酶慢性作用上調(diào)CD-1小鼠腦組織TRPC1 mR

16、NA及TRPC1蛋白的表達(dá)
　　腹腔注射尿素酶(33 units/kg/day)或者生理鹽水作為對(duì)照組，尿素酶對(duì)在體腦組織TRPC1 mRNA及TRPC1蛋白表達(dá)的影響與氯化銨慢性處理原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用相似，尿素酶作用3天能夠上調(diào)腦組織TRPC1mRNA及TRPC1蛋白的表達(dá)。
　　6、尿素酶慢性作用上調(diào)在體星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1 mRNA表達(dá)，但是對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞TRPC1 mRNA表達(dá)無(wú)影響
　　腹腔注射尿素

17、酶(33 units/kg/day)作用3天后，取腦組織制作懸液通過(guò)FACS分選獲得新鮮星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。尿素酶能夠上調(diào)新鮮星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1 mRNA表達(dá)，在神經(jīng)元細(xì)胞尿素酶沒(méi)有作用。
　　討論
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酰胺合成酶的中樞作用和肝性腦病時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)障礙已經(jīng)獲得了公認(rèn)。而高氨血癥時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)的病理性重塑機(jī)制仍未完全明了。本研究從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)對(duì)高血氨模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)改

18、變進(jìn)行系統(tǒng)研究。我們特別研究了病理濃度的氨慢性處理對(duì):①促代謝性受體誘導(dǎo)Ca2+釋放的影響;②InsP3R和RyR激動(dòng)劑誘導(dǎo)Ca2+釋放的影響;③SOCE的影響;④體外實(shí)驗(yàn)TRPC1基因和蛋白表達(dá)的影響;⑤在體高血氨動(dòng)物模型TRPC1基因和蛋白表達(dá)的影響。
　　首先，我們發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞氨慢性處理（體外高血氨毒性模型）能夠增強(qiáng)代謝性受體激活誘導(dǎo)的Ca2+信號(hào)。這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放是星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2

19、+信號(hào)的主要來(lái)源）增加的直接結(jié)果，因?yàn)榘甭蕴幚硪材軌蛟鰪?qiáng)直接刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放通道InsP3Rs和RyRs引起的Ca2+增加。這種鈣離子增加的機(jī)制可能是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+容量的增加，容量的增加可以增加Ca2+離子的電驅(qū)動(dòng)性和使釋放通道更容易開(kāi)放，也可能是由于鈣離子釋放通道密度的增加，或者兩者均有之。相關(guān)的機(jī)制仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。促代謝性受體激活誘發(fā)的Ca2+信號(hào)增加可以促進(jìn)肝性腦病的病理進(jìn)展，如可以增加囊泡谷氨酸的釋放（氨急性作

20、用促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放已經(jīng)被證實(shí)）。
　　其次，我們發(fā)現(xiàn)氨慢性作用能夠顯著增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞SOCE。SOCE的增加主要反映TRPC1通道的表達(dá)增加，我們已經(jīng)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察到了TRPC1基因和蛋白表達(dá)的增加。同樣的結(jié)果我們也在注射尿素酶致氨損傷的小鼠腦組織發(fā)現(xiàn)。此外，TRPC1只在星形膠質(zhì)細(xì)胞有增加，我們通過(guò)腹腔注射尿素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠分選出的新鮮細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。尿素酶的慢性作用只上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的TRPC1表達(dá)，而不影響

21、神經(jīng)元的TRPC1表達(dá)。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞SOCE主要由TRPC1，4，5通道介導(dǎo)，而在小膠質(zhì)細(xì)胞則認(rèn)為是STIM/ORAI復(fù)合物在起主要作用。我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究證實(shí)特異性siRNA抑制TRPC1的表達(dá)、氟西汀慢性作用或抗雙極抑郁藥能夠抑制原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的SOCE和激動(dòng)劑誘導(dǎo)的Ca2+。TRPC1通道由于它們的滲透性在星形膠質(zhì)細(xì)胞控制著幾種溶質(zhì)離子的信號(hào)，在生理?xiàng)l件下TRPC1允許Ca2+和Na+內(nèi)流。Na+內(nèi)流可以產(chǎn)生溶

22、質(zhì)Na+信號(hào)，這個(gè)信號(hào)可以控制和調(diào)整負(fù)責(zé)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能的很多分子，例如包括:K+緩沖，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)元的代謝支持，這些對(duì)氨誘導(dǎo)的肝性腦病具有重要作用。TRPC1表達(dá)的上調(diào)和SOCE的增加可以被哇巴因抑制劑坎利酮完全抑制，我們之前的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了坎利酮能夠抑制氨誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞水腫?？怖淖饔糜赏郯鸵?Na, K-ATPase/Src/EGFR/PI3K-AKT/ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)，這條信號(hào)通路似乎與氨依賴的細(xì)胞病理學(xué)有關(guān)。

23、這條通路能夠調(diào)整影響肝性腦病的幾種基因的表達(dá)，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-1，水通道蛋白4和GFAP，成為肝性腦病治療干預(yù)的重要靶點(diǎn)。另一個(gè)相關(guān)性的治療策略與抗抑郁有關(guān)，如選擇性5羥色胺再吸收抑制劑氟西汀、抗精神病藥鋰、卡馬西平和丙戊酸均已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能夠減少星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca+庫(kù)來(lái)源的Ca2+信號(hào)，而且下調(diào)TRPC1的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　病理濃度的氨可以增強(qiáng)異丙腎上腺素、右旋美托咪啶、AdA、4-CMC刺激引起的星形膠質(zhì)