腺苷預處理星形膠質細胞氧糖剝奪復氧糖后CX3CL1、GLT-1表達的研究.pdf

1、目的:
　　通過體外分離、純化及鑒定SD大鼠來源的星形膠質細胞(Astrocyte As)的方法，建立氧糖剝奪/復氧糖模型，探討缺氧復氧情況下，腺苷預處理誘導趨化因子(CX3CL1)、星形膠質細胞谷氨酸轉運體蛋白(GLT-1)的表達情況，為臨床治療缺血性腦血管疾病奠定基礎。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)SD大鼠星形膠質細胞，根據(jù)星形膠質細胞在皮層分布的特點，取出生24h內(nèi)的SD大鼠，剝離其腦膜和血管，通過機械吹打法和差

2、速貼壁的發(fā)法處理及進行細胞傳代。用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學改變。
　　2.對培養(yǎng)至第三代或第四代的星形膠質細胞通過免疫熒光法行膠質纖維酸性蛋白酶GFAP的鑒定。
　　3.在24孔板內(nèi)，將融合80％以上的第三代星形膠質細胞進行傳代，隨機分為正常組、模型組(OGD/R)及腺苷預處理組(ADO/R)。24h后細胞基本貼壁，且伸出突觸，貼壁后ADO/R組給予腺苷預處理，即用含100μM腺苷的DMEM預先處理細胞，24h后進行氧糖剝

3、奪過程。正常組不進行此過程，OGD/R組和ADO/R組在糖氧剝奪期均更換為無糖DMEM培養(yǎng)基，把培養(yǎng)板蓋去掉，放入缺氧培養(yǎng)箱（含95％氮氣、5％CO2）的中孵育。缺氧進行5h后，OGD/R組和ADO/R組均更換為復耱DMEM培養(yǎng)基，移入正常細胞培養(yǎng)箱(含37℃、5％CO2)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。正常組細胞在正常培養(yǎng)箱（含37℃、5％CO2）中孵育。用光學顯微鏡觀察各組細胞氧糖剝奪復氧糖后的形態(tài)學變化。
　　4.在96孔板內(nèi)，以1×10

4、5個/mL的密度接種第3代星形膠質細胞，每孔為104個細胞數(shù)，待24h后細胞融合后，經(jīng)過氧糖剝奪處理后，用MTT法檢測各組細胞的活力。
　　5.在24孔板中接種上對數(shù)期生長的星形膠質細胞，細胞融合后，棄掉培養(yǎng)液，然后隨機分組，各組細胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，在相應的各孔中加入1000μL培養(yǎng)基，在復氧復糖24h后，將各組細胞上清液收集出來，按照大鼠CX3CL1 ELISA試劑盒測定CX3CL1濃度。在450nm波長下，用酶標儀測定吸光度

5、OD值，根據(jù)標準曲線計算樣品大鼠CX3CL1的濃度。
　　6.用免疫熒光法檢測各組GLT-1的表達情況。
　　7.用Western blot的方法測GLT-1的表達水平。將各組氧糖剝奪復氧糖后的細胞進行消化，在加蛋白裂解液，冰上裂解20分鐘，蛋白濃度測定后在加上樣緩沖液，經(jīng)過沸水變性5分鐘，在每孔中加40ug蛋白樣品進行電泳，用PVDH膜轉膜，封閉以后經(jīng)1∶500的稀釋比例加入一抗，在4度冰箱過夜后，加HRP標記的二抗，37

6、度孵育箱內(nèi)孵育1h，經(jīng)ECL顯影后，用GAPDH做內(nèi)參進行對照，各組熒光條帶的吸光度值用ImageJ軟件分析。統(tǒng)計學分析目的蛋白GLT-1與內(nèi)參的比值。
　　8.數(shù)據(jù)結果用均數(shù)土標準差((x)±s)來表示，用Spss17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差進行分析，用Turkey法行兩兩比較，采用a=0.05的檢驗水準。
　　結果:
　　1.成功培養(yǎng)原代星形膠質細胞。
　　2.氧糖剝奪5h復氧糖24h后

7、星形膠質細胞的形態(tài)學改變:正常組星形膠質細胞氧糖剝奪復氧糖241h后生長狀態(tài)良好，與之前相比無明顯的形態(tài)學改變;OGD/R組星形膠質細胞胞體因水腫變圓，形狀由不規(guī)則形變?yōu)樗笮?，突起明顯變短或消失;ADO/R組細胞有較輕的水腫改變。
　　3.MXT法細胞活性檢測表明:經(jīng)氧糖剝奪復氧糖24h后，OGD/R組細胞活性明顯下降;與正常組相比，OD值降低(P＜0.05)，說明細胞的活力下降是由細胞損傷或死亡引起的。較OGD/R組，ADO/R

8、組細胞活力較高，說明細胞活力受ADO影響(P＜0.05)。且兩兩比較有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　4.細胞培養(yǎng)液中CX3CL1的測定結果顯示:氧糖剝奪復氧糖24h后細胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度測定表明，OGD/R組星形膠質細胞CX3CL1濃度顯著高于正常組(P＜0.05)，表明細胞缺氧缺糖損傷嚴重，釋放出大量的CX3CL1;ADO/R組與OGD/R組相比，CX3CL1濃度明顯降低(P＜0.05)，表明細胞損傷較OGD/

9、R組輕，CX3CL1的釋放量較少。比較細胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度，三組間兩兩比較有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　5.GLT-1免疫熒光結果顯示:正常組的胞膜與胞質中熒光信號表達最強;經(jīng)氧糖剝奪復糖氧后，OGD/R組胞膜熒光信號表達減弱;而胞質中熒光強度表達弱且無顯著的變化。與OGD/R組相比，ADO/R組胞膜熒光強度降低但顯著高于OGD/R組。
　　6.Westernblot檢測氧糖剝奪/復糖后GLT-1的表達情

10、況顯示:正常組星形膠質細胞在氧糖剝奪5h/復氧糖24h后GLT-1蛋白表達相對最高，ADO/R組次之，OGD/R組最低，三組間兩兩比較有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.星形膠質細胞在氧糖剝奪復氧糖后受損嚴重;
　　2.星形膠質細胞的損傷程度與其活性、CX3CL1的表達濃度呈對應變化的關系;
　　3.腺苷預處理可減少氧糖剝奪復氧糖后星形膠質細胞的損傷程度，并使氧糖剝奪/復氧糖后谷氨酸轉運體蛋