Neuroserpin在大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用研究.pdf

1、缺血性腦卒中是引起人類死亡和致殘的主要疾病之一。神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑(neuroserpin，NSP)屬于serpins超家族，是一種軸突選擇性的神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centralnervoussystem，CNS)表達(dá)。NSP參與調(diào)控CNS細(xì)胞外組織型纖溶酶原激活物(Tissueplasminogenaotivator，tPA)、纖維蛋白溶酶的蛋白水解的活性。研究表明，NSP對缺血的神經(jīng)元或腦組織存在保護(hù)作用

2、。應(yīng)用NSP治療急性腦缺血患者可以降低缺血灶的體積，顯著減少血腦屏障(Blood-brainbarrier，BBB)滲漏、腦水腫程度，減少缺血再灌注所致的細(xì)胞凋亡。我們前期的研究，從體外途徑證實(shí)了NSP可減輕糖氧剝奪(Oxygen-glucosedeprivation，OGD)及tPA對神經(jīng)元的毒性損傷而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，可以抑制缺氧復(fù)氧T預(yù)引起的小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia，MG)的活化和增殖，并且可以減少M(fèi)G的白介素-1β(I

3、ntedeuldn-1β，IL-1β)和一氧化氮(Nitricoxide，NO)等自由基和炎性因子的釋放。本研究觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞活性的變化，研究NSP預(yù)處理對缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性是否存在影響。最后，探討NSP對缺氧復(fù)氧后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的這種影響的可能機(jī)制。我們擬通過本研究進(jìn)一步明確NSP神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　第一部分星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和OGD后復(fù)糖復(fù)氧模型的建立
　　目的：構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD后復(fù)糖復(fù)氧

4、模型為下一步實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造條件。
　　方法：體外傳代培養(yǎng)SD大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞并鑒定。建立缺氧復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation、H/R)模型。
　　結(jié)果：
　　1、傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP特異性抗體的免疫熒光染色證實(shí)純度達(dá)95％以上
　　2、星形膠質(zhì)細(xì)胞在糖氧剝奪6小時(shí)以后，細(xì)胞活性逐漸下降，及至12小時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活性已明顯低于正常對照(P<0.05)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在糖氧剝奪12小時(shí)后再復(fù)

5、糖復(fù)氧時(shí)，隨著復(fù)氧時(shí)間的延續(xù)，其活性持續(xù)下降。至復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí)，星膠細(xì)胞活力只有OGD前的一半左右。
　　結(jié)論：傳代星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型有效。
　　第二部分NSP對OGD后復(fù)糖復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　目的：利用建立的OGD模型，探討NSP能否影響OGD后復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，并檢測其炎癥介質(zhì)釋放的變化情況。
　　方法：
　　1、體外傳代培養(yǎng)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞并鑒定。建立星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型

6、。
　　2、檢測不同濃度NSP對缺氧復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。細(xì)胞隨機(jī)分成正常組、H/R組(OGD12小時(shí)后復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí))、NSP+H/R(分為1.25、2.5、5、10、20、40ng/ml五個(gè)終濃度預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞1小時(shí)，然后OGD12小時(shí)后復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí))。利用MTT法測定細(xì)胞存活率、LDH法測定細(xì)胞損傷程度。
　　3、NSP(5ng/ml)預(yù)處理對H/R星形

7、膠質(zhì)細(xì)胞的影響。細(xì)胞隨機(jī)分成正常組、H/R組(OGD12小時(shí)復(fù)糖復(fù)氧0、2、4、6、8、10、12、24小時(shí))、NSP+H/R(5ng/mlNSP預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞1小時(shí)，然后OGD12小時(shí)復(fù)糖復(fù)氧0、2、4、6、8、10、12、24小時(shí))。利用MTT法測定細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)，行AnnexinV-FITC和PI檢測各組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率。
　　4、NSP(5ng/ml)預(yù)處理對H/R星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放自由基NO及IL-1β、TN

8、F-α等細(xì)胞因子的影響。細(xì)胞隨機(jī)分成正常組、H/R組(OGD12小時(shí)后復(fù)糖復(fù)氧0、6、12小時(shí))、NSP+H/R(5ng/mlNSP預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞1小時(shí)，然后OGD12小時(shí)復(fù)糖復(fù)氧0、6、12小時(shí))。以ELISA對細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO、IL-1β及TNF-α的含量分別進(jìn)行測定。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度的NSP預(yù)處理后，OGD12小時(shí)后復(fù)糖復(fù)氧24小時(shí)(OGD12hR24h)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力較對照組有明顯的升高，而

9、細(xì)胞毒性明顯下降。在NSP較低濃度時(shí)，隨著其濃度的增加，星膠細(xì)胞的活力呈梯度上升，并于5ng/ml時(shí)達(dá)到其最大效應(yīng)。
　　2、NSP預(yù)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞，OGD12小時(shí)后復(fù)糖復(fù)氧不同時(shí)間的星形膠質(zhì)的活力較相應(yīng)復(fù)氧時(shí)間的對照組有明顯的提升。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，NSP預(yù)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD12hR24h時(shí)細(xì)胞凋亡程度比對照組明顯減輕。
　　3、NSP預(yù)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞，在缺氧復(fù)氧過程中釋放自由基NO以及IL-1β及TNF

10、-α等炎性介較對照組均有不同程度的減少。
　　結(jié)論：
　　1、NSP預(yù)處理能夠減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞在H/R過程中的活性下降，并發(fā)揮其抗凋亡作用。
　　2、經(jīng)NSP預(yù)處理，星形膠質(zhì)細(xì)胞對H/R過程中的炎性反應(yīng)有一定程度的抑制。
　　第三部分Neuroserpin對星形膠質(zhì)細(xì)胞作用的機(jī)制
　　目的：探討NSP預(yù)處理對其有絲分裂原激活蛋白酶(MitogenactivationproteinIdnase，MAPK)、絲

11、/蘇氨酸蛋白激酶B(Serine/threonineproteinkinaseB，Akt)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)等各信號通路的變化的影響。方法：體外培養(yǎng)傳代大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞并鑒定。細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、H/R組(OGD12hR24h)、NSP+H/R組(5ng/mlNSP預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞1小時(shí)，然后OGD12hR24h)。提取各處理組細(xì)胞的蛋白，以免疫印跡法分別檢測各處理組MAPK、Akt和

12、NF-κB等各信號通路的主要活性蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、星形膠質(zhì)細(xì)胞在H/R后，MAPK信號通路的幾個(gè)磷酸化蛋白p-ERK1/2，p-JNK，p-P38的表達(dá)均比正常明顯升高。NSP預(yù)處理，并不影響MAPK三條主要信號通路的激活程度。
　　2、星形膠質(zhì)細(xì)胞在H/R后，Akt信號通路的磷酸化蛋白p-Akt表達(dá)比正常明顯升高。NSP預(yù)處理，并不影響Akt信號通路的激活程度。
　　3、星形膠質(zhì)細(xì)胞在H/R后

13、，胞漿p-IKKα/β及胞核NF-κBP65水平顯著升高，提示NF-κB信號通路的激活。而NSP預(yù)處理組，胞漿P-IKKα/β及胞核NF-κBP65的水平較缺氧復(fù)氧對照組明顯低，即NF-κB信號通路受抑制。
　　結(jié)論：星形膠質(zhì)細(xì)胞在H/R后，MAPK，PI3K/Akt以及NF-κB等幾條信號通路均較正常組有不同程度的激活。而NSP預(yù)處理組，NF-κB通路激活可受到明顯抑制。
　　結(jié)論
　　1、NSP預(yù)處理能夠減輕星形膠