亞低溫對星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧-復(fù)氧后縫隙連接功能的影響.pdf

1、目的: 觀察缺氧/復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接的變化以及亞低溫對其變化的影響，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接與腦缺血的關(guān)系以及亞低溫對腦缺血的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法: 利用新生24小時(shí)SD大鼠腦皮質(zhì)為原料，采用Manthorp連續(xù)傳代法建立穩(wěn)定的星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外純化培養(yǎng)體系，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長及分化的形態(tài)學(xué)變化。以神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞，95％以上為陽性細(xì)胞，符合實(shí)驗(yàn)要求。采用三氣

2、培養(yǎng)箱分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃，缺氧12h后分別復(fù)氧30min、1h、2h、3h、6h成功建立了星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，分為正常對照組(C)、常溫缺氧/復(fù)氧組(H/R)、亞低溫干預(yù)缺氧/復(fù)氧組(M+H/R)。用臺盼藍(lán)染色法測定37℃及32℃時(shí)，缺氧/復(fù)氧不同時(shí)間點(diǎn)AC的存活率，作為細(xì)胞受損指標(biāo)，用倒置相差顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。應(yīng)用劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)（SLDT）在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下測定缺氧/復(fù)氧各個(gè)時(shí)間點(diǎn)熒光

3、黃染料（LY）在縫隙連接間的擴(kuò)散距離，以測定縫隙連接水平。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢驗(yàn)缺氧/復(fù)氧各個(gè)時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接的主要成份縫隙連接蛋白Cx43的蛋白表達(dá)水平及亞低溫的干預(yù)效果,并進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 1. AC體外純化培養(yǎng)后，細(xì)胞胞體較大,具有多而粗大的突起,形態(tài)不規(guī)則,輪廓較清晰。GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿呈棕黃色。
　　 2. 37℃缺氧12小時(shí)后，細(xì)胞的形

4、態(tài)、存活力變化不明顯，部分細(xì)胞邊緣皺縮。復(fù)氧開始后，可見AC出現(xiàn)胞體增大,細(xì)胞腫脹, 輪廓不清，突觸回縮，細(xì)胞損傷表現(xiàn)明顯加強(qiáng)等現(xiàn)象，隨復(fù)氧時(shí)間的延長，可見細(xì)胞碎片和漂浮細(xì)胞增多。細(xì)胞存活力下降，呈明顯的時(shí)效關(guān)系。亞低溫干預(yù)時(shí)大部分細(xì)胞狀態(tài)較常溫組好。細(xì)胞輪廓較清晰，胞周光暈明顯，突起存在，僅有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)分離現(xiàn)象。細(xì)胞存活力較常溫缺氧/復(fù)氧組增加。
　　 3.劃痕染料示蹤方法觀察熒光黃染料擴(kuò)散距離發(fā)現(xiàn)： 37℃缺氧12h，染料

5、仍可在細(xì)胞間進(jìn)行擴(kuò)散，擴(kuò)散距離較對照組無明顯變化(P>0.05)，復(fù)氧開始后染料擴(kuò)散距離明顯下降，于復(fù)氧2h降至最低，而后隨復(fù)氧時(shí)間延長擴(kuò)散距離呈逐漸增加趨勢，與對照組復(fù)氧各時(shí)間點(diǎn)相比差異有顯著性(P<0.01)。 亞低溫干預(yù)缺氧/復(fù)氧時(shí)熒光染料擴(kuò)散距離在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較37℃缺氧/復(fù)氧組減少，差異有顯著性 (P<0.01)。
　　 4. 細(xì)胞免疫熒光半定量方法觀察Cx43的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：37℃缺氧/復(fù)氧各時(shí)間點(diǎn)蛋白熒光強(qiáng)度較對照組無

6、明顯變化（P>0.05)；亞低溫干預(yù)缺氧12h，Cx43熒光強(qiáng)度較對照組減少（P<0.01),而復(fù)氧后CX43熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先降低后升高趨勢。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與37℃缺氧/復(fù)氧組相比差異有顯著性(P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1. 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞對缺氧有耐受性，復(fù)氧后細(xì)胞損害隨著時(shí)間延長逐漸加重。 亞低溫可以減輕缺氧/復(fù)氧時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。
　　 2. 星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧后縫隙連接仍處于開放狀