星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接參與調(diào)節(jié)鏡像痛作用機(jī)制的研究.pdf

1、軀體某一部位損傷后，除了損傷的部位出現(xiàn)自發(fā)性疼痛或者痛敏外，身體對側(cè)相對應(yīng)的部位也出現(xiàn)自發(fā)痛或痛敏的現(xiàn)象，稱為鏡像痛(Mirror-imagePain)，它是神經(jīng)病理性疼痛中的一種特殊現(xiàn)象。至今鏡像痛的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，越來越多的證據(jù)表明，脊髓內(nèi)星形膠質(zhì)活化在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接之間的關(guān)系在鏡像痛的形成中發(fā)揮怎樣的作用目前還沒見文獻(xiàn)報(bào)道。于是我們提出一個(gè)假設(shè)即在一側(cè)外周神經(jīng)

2、損傷的情況下，術(shù)側(cè)脊髓背角釋放更多神經(jīng)遞質(zhì)，然后通過PKC通路使CX43蛋白磷酸化，增強(qiáng)縫隙連接通訊的功能，使星形膠質(zhì)細(xì)胞通過縫隙連接有術(shù)側(cè)活化到對側(cè)，引起鏡像痛。
　　縫隙連接（gap junction，GJ）是細(xì)胞間進(jìn)行信息直接交流的一種方式。縫隙連接是由特殊的連接蛋白(connexin，CX)構(gòu)成的兩個(gè)半通道互相錨定而成。可允許離子和其他一些小分子物質(zhì)，如三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸肌醇(IP3)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)及一

3、些小分子氨基酸自由通過。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白主要是有縫隙連接蛋白43(CX43)構(gòu)成。CX43的表達(dá)量對縫隙連接通訊功能有重要的作用。在一些神經(jīng)病理性疼痛模型中（脊髓損傷），脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CX43高表達(dá)，這可能提示神經(jīng)病理性疼痛中縫隙連接通訊功能是增強(qiáng)的。我們選擇了坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(spared nerveinjury, SNI)來驗(yàn)證縫隙連接通訊對鏡像痛的影響。通過鞘內(nèi)注射甘珀酸(carbenoxo

4、lone，CBX)，一種縫隙連接通訊阻斷劑，發(fā)現(xiàn)術(shù)后連續(xù)給藥5天，降低了脊髓雙側(cè)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，同時(shí)緩解了大鼠雙側(cè)后肢的機(jī)械縮足閾值。這說明縫隙連接通訊在鏡像痛的發(fā)生中起著重要的作用，且可能是通過減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)樵谇捌诘膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可以緩解大鼠的鏡像痛。
　　神經(jīng)損傷后我們通過鞘內(nèi)注射甘珀酸可以間接反映出縫隙連接的通訊功能是增強(qiáng)的，而沒辦法直接在動(dòng)物體內(nèi)去驗(yàn)證縫隙連接的通訊功能。于是我

5、們通過體外星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，用谷氨酸刺激培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，來模擬疼痛環(huán)境，觀察在疼痛的情況下縫隙連接通訊功能的變化?？p隙連接蛋白的表達(dá)及磷酸化形式對縫隙連接通訊功能的影響有重要的作用。CX43蛋白的半衰期較短(1～5h)，且其磷酸化形式是動(dòng)態(tài)的，可以有不同的磷酸激酶調(diào)節(jié)。其磷酸化形式可以影響CX43蛋白的半衰期，及通道的開放和關(guān)閉狀態(tài)。有報(bào)道顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的縫隙連接通訊功能可以被蛋白激酶C(PKC)調(diào)節(jié)，其作用是通過磷酸化C

6、X43蛋白的羧基端365磷酸化位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的。另外，縫隙連接通訊功能和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化也有著重要的關(guān)系。于是，我們同時(shí)也探討了縫隙連接通訊功能的改變和CX43蛋白磷酸化的關(guān)系，及縫隙連接通訊功能和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在谷氨酸刺激的情況下，PKC蛋白增加，CX43磷酸化增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊功能增強(qiáng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增加。而給予PKC抑制劑之后，CX43的磷酸化降低，同時(shí)縫隙連接通訊功能降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化減少

7、，表明CX43的磷酸化可以增強(qiáng)縫隙連接的通訊功能。那么縫隙連接的通訊功能增強(qiáng)是否會(huì)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，我們給予甘珀酸，阻斷縫隙連接通訊，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的活化減少了，表明縫隙連接的通訊功能增強(qiáng)可以引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。
　　結(jié)合上邊兩個(gè)實(shí)驗(yàn)我們大致可以得出這樣一個(gè)結(jié)論，即在一側(cè)外周神經(jīng)損傷的情況下，術(shù)側(cè)脊髓背角釋放更多的谷氨酸，然后通過PKC通路使CX43蛋白磷酸化，增強(qiáng)縫隙連接通訊的功能，使星形膠質(zhì)細(xì)胞通過縫隙連接有術(shù)

8、側(cè)活化到對側(cè)，引起鏡像痛。
　　本研究將為闡明縫隙連接在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及機(jī)制提供新資料，為探尋神經(jīng)病理性疼痛的防治靶點(diǎn)及藥物開發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分:鞘內(nèi)注射甘珀酸降低CX43的表達(dá)對大鼠鏡像痛的影響
　　目的:
　　研究大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞CX43的表達(dá)變化及對鏡像痛的影響。
　　方法:
　　96只SD大鼠隨機(jī)分為四組，Sham組，SNI組，SNI+NS組，SNI+CBX組，每

9、組24只。各組分別于術(shù)前1d術(shù)后3、7、10、14、21 d觀察大鼠疼痛行為學(xué)變化，其中Sham組，SNI組于術(shù)后14 d采用免疫組化法分析縫隙連接蛋白43(Cx43)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)情況;SNI+CBX組于術(shù)后第5至第9天鞘內(nèi)注射甘珀酸10μL(20μg)，SNI+NS組注射等量生理鹽水，并與術(shù)后10、14、21 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用Westernblot的方法檢測脊髓內(nèi)CX43蛋白表達(dá)情況，采用免疫組化法分析GFA

10、P的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　SNI組與Sham組相比，行為學(xué)上大鼠雙側(cè)機(jī)械縮足閾值降低，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞CX43及GFAP表達(dá)增加(P＜0.05); SNI+CBX組與SNI+NS組相比，Westernblot顯示CX43表達(dá)降低，免疫組化顯示脊髓背角雙側(cè)GFAP表達(dá)降低(P＜0.05)，術(shù)后14d，21d大鼠雙側(cè)機(jī)械縮足閾值升高。
　　結(jié)論:
　　鞘內(nèi)注射甘珀酸降低了CX43的表達(dá)可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活

11、化，并緩解大鼠雙側(cè)后肢的機(jī)械痛。
　　第二部分:谷氨酸增強(qiáng)縫隙連接通訊功能對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響
　　目的:
　　通過離體培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，探討谷氨酸對縫隙連接通訊功能的調(diào)控作用及對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、谷氨酸刺激組（10μmol/L谷氨酸作用24 h）、PKC抑制劑組及CBX阻斷組(20μmol/L甘珀酸作用24 h)。western blotting法檢測各

12、組星形膠質(zhì)細(xì)胞中p-Cx43、p-PKC、GFAP、P-ERK蛋白的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光法檢測各組星形膠質(zhì)細(xì)胞P-Cx43胞膜蛋白的表達(dá)及GFAP蛋白的表達(dá);劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)檢測各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接通訊功能。
　　結(jié)果:
　　谷氨酸刺激組與正常對照組相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Cx43、p-PKC、GFAP蛋白的表達(dá)增加，細(xì)胞縫隙連接通訊功能增強(qiáng)(P＜0.01);在谷氨酸刺激的基礎(chǔ)上給予pke抑制劑作用后p-Cx43、GF