雄激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫的機(jī)制研究.pdf

1、雄激素(Androgen)是體內(nèi)一類(lèi)碳-19固醇物質(zhì)的總稱(chēng)，包括睪酮(Testosterone，T)、雙氫睪酮(DihydrotestosteroneDHT)等。腦是雄激素作用的重要靶器官，雄激素不僅對(duì)腦的記憶與認(rèn)知功能有一定的影響，還對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)調(diào)節(jié)作用。目前雄激素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用的研究多以神經(jīng)元為研究對(duì)象。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)數(shù)量最多的一種膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)、支持、調(diào)節(jié)等重要的作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定和功能的正常

2、發(fā)揮有著重要的作用。研究雄激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，不僅為雄激素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)調(diào)節(jié)作用提供理論依據(jù)，還對(duì)一些神經(jīng)性疾病，尤其是與雄激素相關(guān)的一些老年性疾病的治療和預(yù)防有重要的理論價(jià)值。
　　為了更有效的研究雄激素對(duì)體外星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫學(xué)機(jī)制的作用，需要構(gòu)建合理的星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。本實(shí)驗(yàn)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞取自1～3日齡的SD大鼠的新生鼠，然后經(jīng)過(guò)原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)，并經(jīng)多次純化和傳代獲得所需細(xì)胞，所得細(xì)胞的純化率

3、達(dá)99％以上。可為體外研究提供符合要求的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用10μg/ml的LPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，再分別用濃度為0nM、10nM、100nM的5α-DHT處理激發(fā)培養(yǎng)的AST24h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨5α-DHT濃度增加細(xì)胞的活性下降，其中LPS+10nM5α-DHT組細(xì)胞活性較LPS+0nM5α-DHT組下降且差異顯著(P＜0.05)，而與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)。當(dāng)采用10μg/ml的LPS激發(fā)培養(yǎng)A

4、ST10h后，再用濃度為10nM的5α-DHT處理激發(fā)培養(yǎng)的AST24h后，分別檢測(cè)0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示24h時(shí)只加LPS組比LPS+5α-DHT組活性高14.03％，差異顯著（P＜0.05），其它組差異不顯著。
　　細(xì)胞的免疫功能與細(xì)胞周期有一定相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，加入含濃度為0nM、10nM5α-DHT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24

5、h后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10nM5α-DHT能顯著抑制10μg/mlLPS誘導(dǎo)的S+G2期細(xì)胞比率的升高（P＜0.05）。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生超微結(jié)構(gòu)的改變，為了解雄激素對(duì)其超微結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用，本試驗(yàn)采用10μg/mlLPS激發(fā)AST10h后，試驗(yàn)組用10nM5α-DHT繼續(xù)處理24h，對(duì)照組加0nM5α-DHT處理，利用常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞電鏡制備技術(shù)制作電鏡標(biāo)本。結(jié)果表明10μ

6、g/mlLPS使AST粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分線粒體腫脹，甚至空泡化，而LPS+10nM5α-DHT組異常的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體明顯減少。
　　為了了解雄激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫介質(zhì)分泌水平的影響，試驗(yàn)用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，加入含濃度為0nM、10nM5α-DHT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后測(cè)定ASTNO、IL-1β和TNF-α水平。發(fā)現(xiàn)，隨著雄激素濃度升高，由LPS誘導(dǎo)的ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌水平

7、下降，其中10nM5α-DHT可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO、IL-1β和TNF-α的分泌（P＜0.05）。
　　為了進(jìn)一步確定ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌水平下降是雄激素作用的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，加入含濃度為0nM5α-DHT、10nM5α-DHT、10nM5α-DHT+100nM氟他胺的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后測(cè)定ASTNO、IL-1β和TNF-α水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加氟他胺組雄激素失

8、去對(duì)LPS的抑制作用。同時(shí)，檢測(cè)10μg/mlLPS+10nM5α-DHT組和10μg/mlLPS+10nM5α-DHT+100Nm氟他胺組0.5h、1h、2h、8h、12h、24h時(shí)ASTNO、IL-1β和TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)10μg/mlLPS+10nM5α-DHT組ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌逐漸下降，10μg/mlLPS+10nM5α-DHT+100Nm氟他胺組ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌逐漸升高。

9、>　　為了了解雄激素作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，試驗(yàn)用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，添加10nM5α-DHT，在加5α-DHT前30min分別加20μMp38抑制物SB203580、20μMERK-1/-2抑制物U0126，對(duì)照組加0μMSB203580和U0126，繼續(xù)培養(yǎng)10min后測(cè)定ASTNO、IL-1β和TNF-α水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄激素可以通過(guò)ERK-1/-2轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑調(diào)節(jié)AST免疫反應(yīng)。檢測(cè)20μMSB203580和20μ

10、MU0126組5min、10min、20min、30min時(shí)ASTNO、IL-1β和TNF-α水平，結(jié)果顯示20μMSB203580組ASTNO和IL-1β水平變化不顯著，而TNF-α水平逐漸下降，20μMU0126組ASTNO、IL-1β和TNF-α水平均無(wú)顯著變化。
　　綜上所述，本試驗(yàn)可以得到如下結(jié)論:
　　1、本試驗(yàn)構(gòu)建了雄激素調(diào)節(jié)AST功能的體外研究模型。
　　2、雄激素可以顯著抑制10μg/mlLPS引起的