Calretinin調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素生成及其機制的研究.pdf

1、目的:
　　睪丸主要作用是生成精子和合成雄激素，前者完成于生精小管，后者由睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells)完成。雄激素的合成和分泌受到下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）的調(diào)控。黃體生成激素(LH)結(jié)合其受體(LHR)，激活環(huán)化腺苷酶，將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，激活蛋白激酶A(PKA)通路;激活磷脂酶C(PLC)，將磷脂酰肌醇分為二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，激活PKC通路。兩者促進(jìn)急性類固醇激素生成急性調(diào)節(jié)蛋白(ST

2、AR)和其它類固醇激素生成酶，促進(jìn)雄激素的合成。IP3激活肌漿網(wǎng)鈣池，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子增多，與DAG共同作用;Ca2+作為第二信使參與調(diào)節(jié)雄激素的合成。此外，還受到睪丸局部旁分泌和自分泌調(diào)節(jié)如胰島素樣生長因子、甲狀腺激素、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、促細(xì)胞分裂因子、腫瘤壞死因子（TNF）等。因此，睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成受到內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌因子的復(fù)雜網(wǎng)路的調(diào)節(jié)。
　　鈣視網(wǎng)膜蛋白(calretinin)是一種鈣結(jié)合蛋白，主要表

3、達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中，也在卵巢、睪丸中存在。Calretinin主要作用是緩沖細(xì)胞內(nèi)的鈣離子(Ca2+)濃度，防止Ca2+超載，也可作為Ca2+感受器發(fā)揮作用而Ca2+參與調(diào)節(jié)雄激素合成。課題組前期研究表明，calretinin在大鼠間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且在成年期大鼠間質(zhì)細(xì)胞calretinin表達(dá)最高;以間質(zhì)細(xì)胞系為模型，calretinin超表達(dá)后，間質(zhì)細(xì)胞睪酮生成增多。提示calretinin作為間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的因子參與調(diào)節(jié)雄激素合成。

4、>　　綜上，我們認(rèn)為calretinin作為間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的因子，可影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，通過PKC等通路促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞雄激素的合成。Calretinin也可以通過促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖、抑制凋亡作用間接促進(jìn)睪丸雄激素合成的功能。為驗證以上科研假說，本研究以二種睪丸間質(zhì)細(xì)胞系為模型，研究calretinin對間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成的作用及其機制。
　　方法:
　　(1)驗證本實驗室自行構(gòu)建的LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢

5、病毒，分別轉(zhuǎn)染小鼠間質(zhì)細(xì)胞系(MLTC-1)和大鼠間質(zhì)細(xì)胞系（R2C），通過免疫熒光技術(shù)、Westernblot方法證明轉(zhuǎn)染病毒表達(dá)的有效性;
　　(2)培養(yǎng)MLTC-1、R2C細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體，體外培養(yǎng)96h，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;
　　(3)MLTC-1、R2C細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體，Westernblot觀察增殖及

6、凋亡相關(guān)因子:AKT、p-AKT、Bcl2、Bax、cytochromeC、cleaved-caspase3/9、caspase-3/9、cleaved-PARP、PARP的改變;
　　(4)LV-siRNA-calb2慢病毒載體轉(zhuǎn)染R2C細(xì)胞，體外培養(yǎng)96h，放射免疫法測定血清孕酮水平;
　　(5)R2C細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-siRNA-calb2慢病毒載體，Western blot方法觀察調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成的PKC信號通路相

7、關(guān)蛋白如PLC、p-PKCμ(PKD)、PKD、p-MARCKS、MARCKS、CREB、STAR的變化;
　　(6)MLTC-1、R2C細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒載體，并用鈣離子探針X-Rhod-1標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化;
　　(7)統(tǒng)計學(xué)方法:SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means計學(xué)處)表示，獨立樣本t檢驗分析。P＜

8、0.05代表統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　(1)LV-calb2慢病毒感染MLTC-1細(xì)胞96小時后，與對照組比較，calretinin表達(dá)上調(diào)2-3倍(p＜0.001)。LV-siRNA-calb2感染R2C細(xì)胞，calretinin表達(dá)下降(p＜0.05），干涉效率達(dá)60-70％左右。這表明LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒是高效的。
　　(2)超表達(dá)calretinin后，MLTC-1細(xì)

9、胞凋亡率減少(p＜0.001)，而干涉calretinin后R2C細(xì)胞凋亡率增加(p＜0.05)。
　　(3)超表達(dá)calretinin后，MLTC-1細(xì)胞p-AKT、Bcl2/Bax比值增多(P＜0.05)，而cytochromeC、cleaved-caspase3/9、caspase-3/9、cleaved-PARP、PARP表達(dá)減少(p＜0.05)，AKT表達(dá)不變(p＞0.05);干涉calretinin后，R2C表達(dá)p-A

10、KT、Bcl2/Bax比值減少，而cytochromeC(p＜0.05)、cleaved-caspase3/9、caspase-3/9、cleaved-PARP、PARP增多，AKT表達(dá)不變。
　　(4)干涉calretinin后，R2C的細(xì)胞分泌孕酮減少(p＜0.05)。
　　(5)干涉calretinin后，PKC通路的信號分子PLC、p-PKD、p-MARCKS、MARCKS、CREB，STAR表達(dá)減少(p＜0.05)

11、，PKD表達(dá)不變(p＞0.05)。
　　(6)超表達(dá)calretinin后，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平增高(p＜0.05);干涉calretinin后細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平減少(p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1)Calretinin促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素的合成。
　　(2)Calretinin作為間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的因子，通過PLC-Ca2+-PKC信號通路參與調(diào)節(jié)類固醇激素合成。
　　(3)Calretinin

12、促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的增殖，抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，其機制可能是通過加強PI3K-AKT和ERKl/2信號促進(jìn)細(xì)胞增殖，而PI3K-AKT和ERK1/2信號也可抑制線粒體凋亡通路，從而抑制間質(zhì)細(xì)胞的凋亡。提示calretinin對間質(zhì)細(xì)胞的保護性作用，并間接促進(jìn)睪丸內(nèi)雄激素的合成。
　　(4)本研究證明calretinin參與調(diào)節(jié)睪丸雄激素合成及睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡，并闡明其作用機制。這對于進(jìn)一步闡明間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的分子調(diào)節(jié)機制具有重要理論