中藥復(fù)方對兔睪丸間質(zhì)細(xì)胞的作用研究.pdf

1、補(bǔ)腎壯陽類中藥是我國醫(yī)學(xué)寶庫的重要組成部分。傳統(tǒng)的壯陽類中藥大多具有性激素或促性腺激素樣作用，雄激素可提高性中樞的興奮性，從而誘發(fā)性欲沖動，并維持正常的性機(jī)能。鑒于睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig細(xì)胞)是雄性機(jī)體分泌睪酮的主要細(xì)胞，分泌量約占身體總睪酮的95％；國際上將對男性生殖疾病治療的研究重點集中在Leydig細(xì)胞的培養(yǎng)和移植上。目前，主要對Leydig細(xì)胞的體外生長和激素調(diào)控進(jìn)行研究，而補(bǔ)腎壯陽類中藥對其影響的研究報道較少，特別是關(guān)于中

2、草藥復(fù)方提取物有效活性成分對Leydig細(xì)胞的直接作用的研究，未見相關(guān)報道。 本研究篩選出對兔精液品質(zhì)等指標(biāo)有顯著改善效果的中藥復(fù)方，精制后分別對公兔體內(nèi)和體外的睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究，試驗內(nèi)容主要包括如下5個方面。 1.篩選出一種對兔精液品質(zhì)和性反應(yīng)時間改善效果較好的中藥復(fù)方和提取溶劑。試驗用純水和70％的乙醇分別對四個復(fù)方進(jìn)行提取，制成八種提取物，以1％的比例添加到公兔的日糧中，對公兔的性反應(yīng)時間和精液品質(zhì)等指標(biāo)進(jìn)行評

3、定。結(jié)果顯示，中藥提取物對公兔性反應(yīng)時間的影響差別較大，醇提物組對性反應(yīng)時間的改善效果顯著優(yōu)于水提組和對照組，以復(fù)方B最為明顯(P＜0.01)，水提物組對性反應(yīng)時間的影響和對照組無明顯差異(P＞0.05)；在常規(guī)指標(biāo)中，中藥復(fù)方提取物對精子的密度、射精量、精子活率都有明顯的改善效果；復(fù)方B的醇提物對精子密度的改善效果最為顯著，與其它組比較差異極顯著(P＜0.01)，對射精量和活率的改善效果較其余組差異明顯(P＜0.05)；但對精子畸形率

4、的影響較小(P＞0.05)；在對精子自身生物學(xué)功能及結(jié)構(gòu)的檢查中，復(fù)方B醇提物能顯著改善精子質(zhì)膜的完整率(P＜0.05)；除復(fù)方B醇提物外，其余中藥復(fù)方提取物對精子的頂體的保護(hù)作用無明顯差異(P＞0.05)。 2.本試驗在前一試驗的基礎(chǔ)上，對篩選出的復(fù)方B用70％乙醇進(jìn)行精制，并按照提取物成分的性質(zhì)進(jìn)行分離，最后用紙色譜法對分離的成分進(jìn)行定性研究。結(jié)果顯示，70％乙醇能有效地對復(fù)方中的成分進(jìn)行提??；提取物中主要含有黃酮類、有機(jī)酸

5、類、生物堿以及糖類和氨基酸類物質(zhì)。 3.嘗試建立兔睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。試驗中將獲得的兔睪丸分成4組，進(jìn)行不同的處理：A組在4℃PBS中保存3h后，進(jìn)行消化處理；B組立即進(jìn)行消化處理；C組在4℃PBS中保存3h后，在34℃培養(yǎng)基中孵育15min后，進(jìn)行消化；D組在消化前只進(jìn)行34℃培養(yǎng)基孵育處理。消化后，將過濾法和Percoll梯度分離法結(jié)合在一起對獲得的細(xì)胞進(jìn)行純化處理。結(jié)果顯示，C組的處理程序?qū)?xì)胞的獲取量、完整率的影響

6、效果與B組比較差異極顯著(P＜0.01)，與A組、D組比較差異顯著(P＜0.05)；同時，兩種純化方法結(jié)合可使睪丸間質(zhì)細(xì)胞的純度平均達(dá)到92.55％；體外培養(yǎng)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞的貼壁、生長狀態(tài)良好。 4.本試驗將精制的復(fù)方B醇提物離心去除顆粒，并過濾除菌，溶解于培養(yǎng)基中。將純化好的睪丸間質(zhì)細(xì)胞分成4組，添加含不同濃度中藥復(fù)方B醇提物的培養(yǎng)液，進(jìn)行體外培養(yǎng)，對培養(yǎng)液睪酮水平和細(xì)胞的DNA損傷等指標(biāo)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，中藥復(fù)方對睪丸間質(zhì)

7、細(xì)胞睪酮的分泌有明顯的促進(jìn)作用，10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml組能延長睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌高峰時間至36h，且能維持培養(yǎng)液中高水平睪酮含量至72h；添加復(fù)方B醇提物50μg/ml組和100μg/ml組培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)一段時間后，細(xì)胞核明顯，胞質(zhì)顏色變深，在高劑量組(100μg/ml)則出現(xiàn)細(xì)胞分布不均的現(xiàn)象；在睪丸間質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞凝膠電泳中，發(fā)現(xiàn)10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml試驗組個別細(xì)胞拖尾現(xiàn)象

8、極輕，幾乎沒有，而在100μg/ml組少數(shù)細(xì)胞有輕度的拖尾。 5.將復(fù)方B醇提物按一定比例添加到公兔日糧中，飼喂3周。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，將各組公兔的睪丸制成切片，同時分離培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長狀況并對睪酮的分泌水平進(jìn)行測定。結(jié)果表明，各試驗組(0.0％組、0.5％組、1％組、2％組)的組織切片無任何病理變化；分離的睪丸間質(zhì)細(xì)胞在體外貼壁、生長良好；且睪酮分泌水平與復(fù)方B添加的劑量成正相關(guān)。 綜上所述，通過檢測兔精