膽固醇對體外大鼠睪丸間質細胞分泌睪酮的影響研究.pdf

1、目的：
　　通過低濃度Ⅱ、Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化法從幼年SD大鼠睪丸中分離出睪丸間質細胞（LCs），在含不同濃度的膽固醇的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，探討體外不同濃度的膽固醇對大鼠睪丸間質細胞分泌睪酮的影響，為臨床上進一步預防和治療性腺功能低下提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　本研究分為兩個部分：第一部分：隨機選取健康4周齡雄性SD大鼠12只作為母體，采用低濃度Ⅱ、Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化法從幼年SD大鼠睪丸中分離出LCs，并對其純化、培養(yǎng)

2、及鑒定。第二部分：將原代培養(yǎng)的LCs隨機分成對照組A及實驗組B。對照組A又分為對照組A1和A2，實驗組B分為實驗組B1、B2、B3和B4。其中對照組A1加入標準培養(yǎng)基2（DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清5％、二抗10萬U/L，LDL-C1.0ug/ml）；對照組A2，為含有HCG（0.5IU/ml）的標準培養(yǎng)基2；實驗組B1：在對照組A1的基礎上分別加入低密度脂蛋白膽固醇（lipoprotein cholestero；LDL-C）0.2

3、、0.5、1.0、5ug；實驗組B2：在對照組A2的基礎上分別加入LDL-C0.2、0.5、1.0、5ug；實驗組B3：在對照組A1的基礎上分別加入氧化低密度脂蛋白膽固醇（oxidized lipoprotein cholesterol；ox-LDL-C）0.2、0.5、1.0、5ug；實驗組B4：在對照組A2的基礎上分別加入ox-LDL-C0.2、0.5、1.0、5ug。在培養(yǎng)24h后收取培養(yǎng)液，用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-lin

4、ked immunosorbent assay；ELISA）法測定睪酮，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　　第一部分低濃度Ⅱ、Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化法分離純化大鼠睪丸間質細胞
　　1)采用0.1%Ⅱ、Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化法分離LCs的最佳酶解時間為1h左右。
　　2）利用差速貼壁純化LCs的最佳貼壁時間為1-2h。
　　3）培養(yǎng)24小時后，3β-HSD免疫熒光染色鑒定LCs，純度為98.1±1.5%，臺盼藍

5、染色鑒定LCs存活率為97.3±1.6%。
　　4）貼壁后培養(yǎng)12小時內(nèi)，LCs即達分泌高峰，隨培養(yǎng)時間的延長，LCs分泌睪酮的能力逐漸下降。
　　第二部分不同濃度的膽固醇對體外培養(yǎng)大鼠LCs分泌睪酮的影響
　　1）實驗組B1中：經(jīng)統(tǒng)計學分析，與加入0.2ug、1.0ug及5.0ug LDL-C組比較，加入0.5ug LDL-C的培養(yǎng)基中，所含睪酮濃度最高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。與對照組A1比較加入0.5ug

6、 LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度更高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。加入0.2ug及1.0ug LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度與對照組A1中睪酮濃度比較，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。加入5ug LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度低于對照組A1中睪酮濃度，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　2）實驗組B2中：經(jīng)統(tǒng)計學分析，加入0.5ug及1.0ug LDL-C的培養(yǎng)基中，所含睪酮濃度最高，兩者之間比較，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義，

7、與加入0.2ug及5.0 ug LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度比較，0.5ug及1.0ug組，睪酮濃度較高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。與對照組A2比較，加入0.2ug、0.5ug及1.0ug LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度均顯著增高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。與對照組A2比較加入5.0ug LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度明顯降低，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3）實驗組B3中：與對照組A1比較，加入0.2ug、0.5

8、ug ox-LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度均低于對照組A1中睪酮濃度，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，1.0ug及5.0ug組中睪酮濃度低于0.15ng/ml，低于標準曲線測量范圍，測量值可能存在較大誤差，故不做比較。
　　4）實驗組B4中：與對照組A2比較，加入0.2ug、0.5ug、1.0ug及5ug ox-LDL-C的培養(yǎng)基中睪酮濃度均低于對照組A2，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，睪酮濃度隨加入的ox-LDL-C的增加明顯下

9、降。
　　5）實驗組B1與實驗組B2比較，可見實驗組B2中利用LDL-C合成睪酮明顯增加，實驗組B1中加入0.5ug組，睪酮濃度最高，實驗組B2中，0.5ug及1.0ug組睪酮濃度最高，可見實驗組B2可利用更高濃度的LDL-C合成膽固醇。
　　結論：
　　通過低濃度Ⅱ、Ⅳ型膠原酶聯(lián)合消化法可以獲得足夠多具高活性的高純度睪丸間質細胞，并且LCs增殖能力較強。適當增加LDL-C濃度可促進體外培養(yǎng)的LCs合成睪酮，過高濃度的