胰島素抵抗肥胖大鼠orexin A及其受體1調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的分子機(jī)制研究.pdf

1、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是由于各種原因使胰島素在周?chē)M織攝取和清除葡萄糖的效率下降，機(jī)體代償性的分泌過(guò)多的胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定。肥胖可以導(dǎo)致IR的發(fā)生，而IR又是肥胖癥、高血壓病、血脂代謝異常等代謝綜合征的共同危險(xiǎn)因素。因此，胰島素抵抗一直是內(nèi)分泌的研究熱點(diǎn)。胰島素抵抗和肥胖已經(jīng)成為一個(gè)世界性的問(wèn)題，導(dǎo)致內(nèi)分泌和代謝的改變，包括男性性腺功能減退。性腺功能減退常發(fā)生在肥胖的人，伴有睪酮水

2、平的減低。肥胖常伴有性激素濃度的改變。低濃度的睪酮與腹型肥胖和代謝綜合征有關(guān)，同時(shí)，患心血管疾病的危險(xiǎn)性也增加。美國(guó)馬塞諸塞州的一項(xiàng)有關(guān)男性的研究中，肥胖病人的游離和總睪酮都低于正常人。腹型肥胖使胰島素和C-肽水平升高，而胰島素和C-肽水平與總睪酮和游離睪酮呈負(fù)相關(guān)。
　　下丘腦脈沖式分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)調(diào)節(jié)垂體黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的釋放。LH調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的生物合成，LH的分泌受睪酮和雌激

3、素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。而FSH主要是與支持細(xì)胞上的FSH受體結(jié)合調(diào)節(jié)生精過(guò)程。FSH的分泌受活化素和抑制素的調(diào)節(jié)。除了垂體促性腺激素調(diào)節(jié)睪酮的生物合成，許多的因子也調(diào)節(jié)其分泌和合成，比如增食欲素A(Orexin A)。
　　OrexinA和增食欲素B(Orexin B)是涉及到飲食、能量穩(wěn)態(tài)、睡眠周期、獎(jiǎng)賞、動(dòng)脈血壓和心率、自主神經(jīng)系統(tǒng)和許多內(nèi)分泌軸調(diào)節(jié)的下丘腦神經(jīng)肽。他們通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體增食欲素受體1(OX1R)和增食欲素受體2(O

4、X2R)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織發(fā)揮其生物學(xué)作用。增食欲素(orexins)在中樞水平調(diào)節(jié)GnRH分泌，orexin A和B在類(lèi)固醇存在的條件下刺激LH的分泌，而在卵巢切除大鼠無(wú)類(lèi)固醇的條件下抑制LH分泌，說(shuō)明orexins在中樞對(duì)LH的調(diào)節(jié)有雙向性。除了青春期前期大鼠睪丸幾乎不表達(dá)前增食欲素原(PPO) mRNA，從出生到成年后均有PPO mRNA的表達(dá)，說(shuō)明大鼠睪丸表達(dá)的PPO mRNA可能是年齡依賴性。成年后大鼠睪丸曲精細(xì)管和間質(zhì)

5、均表達(dá)orexinA，但是曲精細(xì)管可能是orexinA表達(dá)的主要部位。成年大鼠睪丸的免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn):orexinA的免疫性在成年大鼠生精細(xì)胞減數(shù)分裂的特定時(shí)期也有表達(dá)，表明orexinA可能參與了大鼠生精周期調(diào)節(jié)。成年后大鼠睪丸也表達(dá)orexin A的受體OX1R。OX1R mRNA的有存在著發(fā)育階段性。在大鼠的體內(nèi)研究中，證實(shí)了睪丸間質(zhì)細(xì)胞不是OX1R mRNA表達(dá)的主要來(lái)源，同時(shí)，并沒(méi)有檢測(cè)到OX2R mRNA的表達(dá)。除了大鼠睪丸表

6、達(dá)OX1R，在人類(lèi)、羊和雞的睪丸也檢測(cè)到OX1R和OX2R的表達(dá)。OX1R也在人類(lèi)睪丸的間質(zhì)細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和支持細(xì)胞表達(dá)。因此orexins及其受體可能參與到生殖系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)。近來(lái)的研究證實(shí)了:在培養(yǎng)的癌癥細(xì)胞中，orexins能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，降低種植在小鼠身上人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而在正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞，orexins卻沒(méi)有這種作用。
　　3β-羥類(lèi)固醇脫氫酶(3β-HSD)是類(lèi)固醇代謝的關(guān)鍵酶，使孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為孕酮，許

7、多器官都表達(dá)3β-HSD，3β-HSD是睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生睪酮的組織化學(xué)標(biāo)志。許多生長(zhǎng)因子、類(lèi)固醇和細(xì)胞因子通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)3β-HSD的表達(dá)。在人類(lèi)H295R腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中，orexinA能夠刺激類(lèi)固醇生成和3β-HSD的表達(dá)。在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中，orexinA刺激的OX1R表達(dá)和p38裂素原活化蛋白酶(MAPK)的磷酸化。而原代提取的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，orexinA通過(guò)何種途徑，是否刺激睪酮分泌還不清楚。
　　本研究

8、通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)建立胰島素抵抗肥胖大鼠模型，應(yīng)用高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型的建立，觀察血漿orexinA的變化及OX1R在睪丸組織的表達(dá)情況;orexinA對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響;orexinA及其受體OX1R對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD表達(dá)及睪酮分泌調(diào)節(jié)，探討orexinA及其受體OX1R對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD表達(dá)及睪酮分泌調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分、Orexin A及OX1R在高脂飲

9、食誘導(dǎo)的胰島素抵抗肥胖大鼠睪丸組織中的表達(dá)研究
　　選擇8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為2組:正常對(duì)照組和高脂飲食組(HF)。對(duì)照組予以普通顆粒飼料，高脂組予以高脂飼料。飼養(yǎng)8周后，每組隨機(jī)選取5只進(jìn)行高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胰島素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心臟取血，分別進(jìn)行血糖、血脂、胰島素、LH、FSH、睪酮和orexinA水平測(cè)定。處死大鼠后，留取睪丸組織，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)睪丸組織OX1R定位表達(dá)，wes

10、tern-blot技術(shù)檢測(cè)睪丸組織OX1R蛋白表達(dá)。
　　第二部分、Orexin A對(duì)3β-HSD的表達(dá)及睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響
　　原代提取大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，用濃度梯度orexin A和OX1R特異性抑制劑(SB334867)進(jìn)行干預(yù)， MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)3β-HSD mRNA的表達(dá)情況。
　　第三部分、OrexinA及OX1R干預(yù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的分子機(jī)制研究

11、>　　原代提取大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞后，western-blot檢測(cè)orexin A對(duì)OX1R、ERK、p38、JNK MAPKs和3β-HSD蛋白水平的影響，RT-PCR方法檢測(cè)orexin A對(duì)OX1RmRNA、OX2R mRNA和3β-HSD mRNA水平的影響，RIA檢測(cè)睪酮水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　第一部分、OrexinA及OX1R在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗肥胖大鼠睪丸組織中的表達(dá)研究
　　（一） IR大鼠體重和

12、血漿中血糖、血脂、FSH、LH、睪酮和orexinA水平
　　HF組大鼠體重、血清TG、TC、LDL-C均顯著高于對(duì)照組，而HDL-C較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HF組血清FSH、LH、睪酮和orexin A水平均低于對(duì)照組。
　　（二）免疫組化和western blot分析各組大鼠睪丸組織OX1R的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示:大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞有OX1R免疫陽(yáng)性表達(dá)，HF組睪丸組織中OX1R陽(yáng)性染色顆粒較對(duì)照組明顯減少。We

13、stern-blot結(jié)果顯示:HF組大鼠睪丸組織OX1R蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。
　　第二部分、Orexin A對(duì)3β-HSD的表達(dá)及睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響
　　（一）Orexin A對(duì)原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　濃度梯度orexinA可促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖，加入OX1R特異性抑制劑可抑制這種增殖作用。10-6M和10-8 M orexin A減少間質(zhì)細(xì)胞凋亡，而10-10M orexin A無(wú)這樣的作用，OX

14、1R特異性抑制劑可抑制orexin A對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。
　?。ǘ?OrexinA對(duì)3β-HSD mRNA水平的影響
　　Orexin A能誘導(dǎo)3β-HSD mRNA水平的增高，OX1R特異性抑制劑可抑制這種作用。
　　第三部分Orexin A及OX1R干預(yù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的分子機(jī)制研究
　　（一） Orexin A對(duì)原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞中OX1R的表達(dá)的影響
　　本研究結(jié)果顯示，OX1R mRN

15、A在原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而無(wú)OX2RmRNA的表達(dá)。Orexin A能劑量依賴性的從基因和蛋白水平刺激其受體OX1R的表達(dá)。10-6 M、10-8M和10-10M orexin A均能增加OX1R mRNA水平，10-6MorexinA對(duì)其受體的影響最大;10-6M和10-8M orexin A在蛋白水平上上調(diào)其受體水平，10-6 M orexin A的影響最大，而10-10M orexin A對(duì)其受體刺激影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

16、　?。ǘ?OrexinA對(duì)ERK、p38和JNK MAPKs蛋白水平的影響
　　本研究用蛋白印跡方法測(cè)定orexin A對(duì)ERK1/2和p38 MAPKs的影響。OrexinA能誘導(dǎo)ERK1/2和p38 MAPK蛋白的磷酸化，而分別用U0126和SB203580預(yù)處理后，能阻滯這種作用。但是，orexinA對(duì)JNK MAPK的磷酸化水平影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　用10-6M orexin A處理的原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞，在5、10

17、和30min均能增加ERK1/2蛋白的磷酸化水平，而在60min未見(jiàn)明顯差異，10min的表達(dá)最高。10-6MorexinA在處理間質(zhì)細(xì)胞5、10、20和30min均能刺激p38 MPAK的磷酸化，10min的表達(dá)最高。SB334867預(yù)處理能夠阻滯10-6 M orexinA對(duì)ERK和p38蛋白的影響
　　（三） Orexin A對(duì)3β-HSD和睪酮水平的影響
　　10-6M orexinA能刺激3β-HSD蛋白和基因水平

18、上的mRNA表達(dá)增多。同時(shí)，培養(yǎng)基中睪酮水平也增加。U0126、SB203580或分別和SB334867聯(lián)合阻滯均能一應(yīng)程度上抑制orexinA作用。
　　結(jié)論：
　　1、胰島素抵抗肥胖大鼠體內(nèi)血漿orexin A水平降低，其受體OX1R在睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)，且其表達(dá)量在IR大鼠睪丸中降低，提示除了中樞系統(tǒng)外，orexin A可能作為一種循環(huán)激素通過(guò)自分泌或者/和旁分泌作用參與能量平衡和睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。