TGF-β1信號(hào)通路調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌雌激素的機(jī)制.pdf

1、背景:
　　在男性生殖系統(tǒng)內(nèi)，一定水平的雌激素對(duì)于維持正常的生殖發(fā)育和精子發(fā)生至關(guān)重要。成年哺乳動(dòng)物睪丸的雌激素主要來源于睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells,LCs），其合成過程受到芳香酶的催化。Cyp19是芳香酶的編碼基因，其轉(zhuǎn)錄活性受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，主要包括SF-1、LRH-1、CREB和 CREM。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta1,TGF-β1）主要通過其經(jīng)典的受體

2、/Smad通路調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程，TGF-β I型受體（TGF-β type I receptor,TβRI）又稱為ALK5（activin receptor-like kinase5），在被TGF-β1信號(hào)活化后可以磷酸化Smad2/3，并通過Smad復(fù)合物將信號(hào)傳遞進(jìn)細(xì)胞核并調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。我們前期研究表明，TGF-β1可以抑制大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞芳香酶的表達(dá)從而抑制雌二醇的分泌。為了進(jìn)一步探究TGF-β1調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌雌激素的機(jī)制

3、，本實(shí)驗(yàn)首先觀察了TGF-β1信號(hào)通路對(duì)芳香酶基因Cyp19相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響，然后在轉(zhuǎn)錄水平探索TGF-β1信號(hào)通路對(duì)Cyp19轉(zhuǎn)錄活性的影響，最后在miRNA水平，進(jìn)一步研究TGF-β1的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)大鼠原代LCs和R2C間質(zhì)瘤細(xì)胞，TGF-β1（5ng/mL）孵育20h；體視顯微鏡下向大鼠睪丸間質(zhì)注射200μl TGF-β1（1μM），采用Western blot和免疫熒光（immunofl

4、uorescence,IF）技術(shù)，在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平，檢測(cè)TGF-β1對(duì)芳香酶基因Cyp19以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SF-1、LRH-1、CREB和CREM表達(dá)的影響。
　　2.為了觀察TGF-β受體在調(diào)節(jié)SF-1/LRH-1表達(dá)中的作用，原代LCs或睪丸間質(zhì)給予TGF-β1及ALK5阻滯劑SB431542，Western blot檢測(cè)SB431542對(duì)SF-1、LRH-1和CYP19蛋白水平的影響；同時(shí)提取睪丸間質(zhì)液（testic

5、ular interstitial fluid,TIF)，通過電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（electrochemiluminescence immunoassays,ECLIA）檢測(cè)雌二醇（estradiol,E2)含量的變化。
　　3.為了篩選LCs中參與TGF-β1通路的Smad分子，R2C細(xì)胞孵育TGF-β1（5ng/mL）20h后，收獲細(xì)胞，Western blot檢測(cè)Smad2和Smad3的磷酸化水平。
　　4.向29

6、3T細(xì)胞轉(zhuǎn)染含Cyp19啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因載體和SF-1/LRH-1表達(dá)載體，然后孵育TGF-β1，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（dual-luciferase reporter gene assay）檢測(cè)TGF-β1對(duì)Cyp19基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　5.向293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染含Cyp19啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因載體和SF-1/LRH-1表達(dá)載體，同時(shí)共轉(zhuǎn)染Smad2表達(dá)載體，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)TGF-β1對(duì)Cyp1

7、9基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　6.R2C細(xì)胞孵育TGF-β1（5ng/mL）20h，提取總RNA，二代測(cè)序技術(shù)分析miRNA表達(dá)譜，并通過靶基因分析，篩選出TGF-β1信號(hào)通路中可能以SF-1和LRH-1為靶基因的miRNA，并通過qRT-PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction）進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.在大鼠原代LCs

8、細(xì)胞、R2C細(xì)胞和睪丸組織中，TGF-β1可以顯著降低芳香酶基因Cyp19及其轉(zhuǎn)錄因子SF-1和LRH-1的表達(dá)水平，但對(duì)CREB和CREM的表達(dá)沒有明顯影響。
　　2.在原代培養(yǎng)的LCs和整體動(dòng)物水平上，SB431542均能明顯恢復(fù)TGF-β1抑制SF-1和LRH-1的表達(dá)，并且在整體動(dòng)物水平上SB431542還能明顯改善TGF-β1抑制CYP19的表達(dá)和睪丸間質(zhì)液雌二醇的合成。
　　3.用TGF-β1刺激R2C細(xì)胞，We

9、stern blot檢測(cè)Smad2和Smad3的磷酸化水平，結(jié)果顯示Smad2磷酸化水平明顯增強(qiáng)，而Smad3的磷酸化水平變化不明顯。
　　4.在293T細(xì)胞中，TGF-β1或過表達(dá)Smad2均可以明顯降低SF-1或LRH-1誘導(dǎo)的Cyp19啟動(dòng)子活性。
　　5.測(cè)序結(jié)果顯示，TGF-β1作用下表達(dá)上調(diào)的miRNA有37個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNA有23個(gè)。通過靶基因分析，篩選出TGF-β1信號(hào)通路中可能以SF-1和LRH-1為

10、靶基因的miRNA，利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在TGF-β1刺激后，可能以SF-1為靶基因的miR-21-3p，miR-532-3和miR-107表達(dá)量明顯升高，可能以LRH-1為靶基因的miR-339-5p表達(dá)量明顯上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.TGF-β1在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平，抑制大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Cyp19相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SF-1和LRH-1的表達(dá)，提示TGF-β1通過抑制SF-1和LRH-1的累積調(diào)節(jié)Cyp1

11、9基因的表達(dá)。
　　2.阻斷TGF-β1受體ALK5，可以減弱TGF-β1抑制LCs表達(dá)SF-1、LRH-1、CYP19和分泌雌二醇，提示TGF-β1通過其經(jīng)典的受體信號(hào)通路，抑制轉(zhuǎn)錄因子SF-1和LRH-1的表達(dá)，繼而減弱CYP19的表達(dá)和雌二醇的合成。
　　3.TGF-β1刺激R2C細(xì)胞后，Smad2蛋白發(fā)生明顯的磷酸化，Smad3的磷酸化水平很微弱，提示Smad2在TGF-β1抑制LCs表達(dá)SF-1和LRH-1的過程中

12、發(fā)揮了主要作用。
　　4.TGF-β1和Smad2均可以抑制SF-1/LRH-1誘導(dǎo)的Cyp19基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，提示TGF-β1通過Smad2信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平抑制Cyp19基因的表達(dá)。
　　5.以SF-1為靶基因的miR-107、miR-21-3p和miR-532-3p，以LRH-1為靶基因的miR-339-5p，在TGF-β1刺激下表達(dá)上調(diào)，提示這四種miRNA可能在TGF-β1調(diào)節(jié)SF-1/LRH-1表達(dá)的過程中發(fā)