AMPK信號通路負(fù)向調(diào)節(jié)熱應(yīng)激誘導(dǎo)仔豬睪丸支持細(xì)胞乳酸分泌.pdf

1、AMP依賴性蛋白激酶（AMP activated protein kinases，AMPK）是一種負(fù)責(zé)代謝和能量需求的蛋白激酶，激活A(yù)MPK可以增強(qiáng)分解代謝（脂肪酸氧化和糖酵解等），而且這一激酶也是細(xì)胞響應(yīng)代謝壓力時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子。睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cells，SCs）的代謝具有“瓦爾堡效應(yīng)”，即使在氧氣充足的情況下也能通過高速的糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，并產(chǎn)生ATP。睪丸支持細(xì)胞分泌的乳酸不僅是生精細(xì)胞發(fā)育的

2、首選能量底物，而且在精子形成過程中還具有抗凋亡的作用。豬睪丸支持細(xì)胞內(nèi)乳酸的分泌受到GLUT3（gluco se transporters3，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體3）、LDHA（lactate dehydrogenases A，乳酸脫氫酶A）和MCT1（monocarboxylate transporter1，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）的調(diào)控。本試驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激（43℃，30 min）能夠促進(jìn)支持細(xì)胞中乳酸的分泌；越來越多的證據(jù)顯示，熱應(yīng)激

3、改變了多種組織和細(xì)胞中AMPK的活性，但是熱應(yīng)激是否可以通過調(diào)節(jié)AMPK活性影響睪丸支持細(xì)胞中乳酸生成目前還不清楚。因此，本文首先研究了熱應(yīng)激處理后仔豬睪丸支持細(xì)胞內(nèi)AMPK活性的變化，然后利用AMPK激活劑和過表達(dá)模型分析AMPK在乳酸分泌中的作用，并分析了AMPK對乳酸合成量以及相關(guān)蛋白GLUT3、LDHA和MCT1 mRNA和蛋白的表達(dá)以及LDH酶活的影響。
　　本研究以3周齡左右的仔豬睪丸作為試驗(yàn)材料，首先用43℃培養(yǎng)箱對

4、體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞進(jìn)行30 min的熱處理，然后將熱處理的細(xì)胞放回32℃培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)0 h，3 h，6 h，12 h，24 h和48 h（熱應(yīng)激后恢復(fù)處理），利用RT-PCR檢測乳酸分泌相關(guān)基因的表達(dá)，運(yùn)用western blot檢測細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平和乳酸分泌相關(guān)蛋白的表達(dá)，收集培養(yǎng)液用乳酸檢測試劑盒進(jìn)行乳酸分泌量的測定，以確定適宜的恢復(fù)時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，用AMPK的激活劑AICAR或轉(zhuǎn)染AMP K過表達(dá)載體，然后熱處理細(xì)

5、胞，利用western blot檢測AMPK的磷酸化水平以及乳酸相關(guān)蛋白GLUT3、LDHA、MCT1的蛋白表達(dá)，利用LDH酶活檢測試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)LDH酶的活性，用RT-PCR檢測AMPK的過表達(dá)效率及乳酸分泌相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)情況。
　　試驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）熱應(yīng)激（43℃處理30 min）后，培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細(xì)胞分泌的乳酸量增加，伴隨著恢復(fù)時(shí)間的延長而增加，在12 h達(dá)到最大值，與對照組相比增加了75%（P＜

6、0.01）。
　?。?）熱應(yīng)激后支持細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化水平降低，且呈時(shí)間依賴性。隨著恢復(fù)時(shí)間的延長而減少，在12 h降到最低，是對照組的58%（P＜0.01）。隨后又逐漸恢復(fù)，在48 h已達(dá)到正常水平。
　?。?）AMPK激動劑AICAR(2 mmol/L,2 h)促進(jìn)了AMPK的磷酸化水平（P＜0.01）；降低了熱應(yīng)激引起的乳酸分泌量增多和GLUT3、LDHA、MC T1的蛋白和mRNA的表達(dá)量增加，下調(diào)了熱應(yīng)激后LDH

7、酶活的增加酶活的增加（P＜0.01）。
　?。?）轉(zhuǎn)染AMPK過表達(dá)載體pcDNA-AMPK能顯著提高AMPK mRNA的表達(dá)量，與對照相比增加了2.34倍（P＜0.01）；然而空白載體 pcDNA單獨(dú)作用卻對AMPK蛋白和mRNA的表達(dá)量并無顯著影響（P＞0.05）。
　?。?）pcDNA-AMPK降低了熱應(yīng)激引起的乳酸分泌量增多和GLUT3、LDHA、MCT1的蛋白和mRNA的表達(dá)量增加以及下調(diào)了熱應(yīng)激后LDH酶活的增加