熱應(yīng)激對(duì)豬和小鼠睪丸組織損傷及tBHQ介導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路保護(hù)作用的研究.pdf

1、公豬生殖力表現(xiàn)為季節(jié)性變化。在炎熱的夏季，公豬精液品質(zhì)降低，生殖力低下。升高的環(huán)境溫度會(huì)誘發(fā)公豬精液品質(zhì)的改變，比如精子活力降低和精子頂體完整率下降以及精子畸形率升高。因此，揭示熱應(yīng)激對(duì)睪丸生精細(xì)胞損傷機(jī)制，尋找緩解或預(yù)防熱應(yīng)激的方法具有一定生產(chǎn)意義。熱通常誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，包括超氧化物自由基、過(guò)氧化氫和羥基自由基。當(dāng)活性氧簇產(chǎn)生量超過(guò)機(jī)體細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)清除能力時(shí)，組織細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。睪丸組織中的多余ROS可被細(xì)胞內(nèi)

2、多種抗氧化酶清除，例如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、血紅素加氧酶1(OH-1)、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基(GCLC)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)等。紅系衍生的核因子2相關(guān)因子2（Nrf2）在各組織細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中處于核心地位。近年研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶類(lèi)基因的表達(dá)，如HO-1、NQO1和GCLC增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，發(fā)揮抗氧化作用。在眾多Nrf2誘導(dǎo)物中，叔丁基對(duì)苯二酚(t

3、BHQ)可通過(guò)Nrf2激活許多下游抗氧化基因的表達(dá)。因此，通過(guò)Nrf2誘導(dǎo)劑tBHQ上調(diào)睪丸組織中抗氧化酶，進(jìn)而提高細(xì)胞抗氧化能力，不失為一個(gè)有效預(yù)防熱應(yīng)激的方法。本試驗(yàn)首先通過(guò)精液品質(zhì)檢測(cè)研究夏季高溫對(duì)公豬精子生成的影響，然后采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)了Nrf2蛋白在小鼠睪丸組織中表達(dá)，并利用RIA、RT-PCR等方法檢測(cè)了熱應(yīng)激小鼠睪丸的相對(duì)重量，氧化應(yīng)激參數(shù)，Cleaved caspase 3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量以及Nrf2及其相關(guān)基

4、因的表達(dá)，就tBHQ可能的緩解機(jī)制進(jìn)行了深入分析研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.夏季高溫對(duì)大白公豬精子生成的影響
　　為了闡明夏季高溫環(huán)境導(dǎo)致公豬精液質(zhì)量低下的機(jī)理，本試驗(yàn)選用5頭性成熟大白公豬，并施以3天連續(xù)高溫暴露。熱暴露前2周和熱暴露后6周，每間隔3天，采集精液1次，并檢測(cè)精液品質(zhì):精液體積、精子總數(shù)、精子活力、精子畸形率、精漿成分，以及精漿和血清中睪酮濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明，與熱暴露前相比，大白公豬熱暴露后第2周末，精

5、子總數(shù)顯著降低(P＜0.05)。精子畸形率在大白公豬熱暴露第3到第5周期間，顯著升高(P＜0.05)，而精子活力顯著下降(P＜0.05)。另外，精液體積，血清中睪酮含量，大白公豬精漿中離子濃度以及總蛋白和白蛋白含量在熱暴露前后都沒(méi)有顯著變化。大白公豬精子畸形率和精子活力在熱暴露6周后逐漸恢復(fù)正常值。試驗(yàn)結(jié)果表明，大白公豬熱暴露可能損害精母細(xì)胞和精細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而擾亂公豬精子生成，降低了公豬精液品質(zhì)。
　　2.全身熱應(yīng)激對(duì)小鼠睪丸組

6、織損傷及Nrf2保護(hù)作用的研究
　　本研究旨在闡明熱應(yīng)激小鼠睪丸中Nrf2與熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的關(guān)系。雄性小鼠每天暴露于高環(huán)境溫度(42℃)中2小時(shí)。連續(xù)12天熱處理，分別于熱處理后第1、2、4、8和12天，采集睪丸樣品，測(cè)定睪丸重量，睪丸組織抗氧化酶活性和丙二醛和谷胱甘肽含量;利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Nrf2蛋白的表達(dá)，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Nrf2及其下游調(diào)控基因的表達(dá)。熱處理后，小鼠直腸、陰囊表面和體表溫度顯著增加。隨

7、著熱處理天數(shù)的增加，血清中皮質(zhì)醇和睪酮的濃度出現(xiàn)波動(dòng)。持續(xù)12天高溫處理導(dǎo)致小鼠體重和睪丸重量顯著下降，丙二醛含量顯著升高，過(guò)氧化氫酶活力顯著下降;熱處理第4天，睪丸組織谷胱甘肽含量顯著增加;總超氧化物歧化酶和銅鋅超氧化物歧化酶的活性在第8天和第12天熱處理后顯著增加。此外，小鼠熱處理后第3天，睪丸組織中生精上皮細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞中Nrf2表達(dá)強(qiáng)烈，尤其間質(zhì)組織中Nrf2蛋白發(fā)生明顯入核;Nrf2及其下游調(diào)控基因HO-1和GCLC顯著升高

8、。結(jié)果表明熱應(yīng)激可減少睪丸組織重量，引起睪丸組織氧化應(yīng)激，胞質(zhì)胞核中強(qiáng)烈表達(dá)的Nrf2以及增加的抗氧化基因表達(dá)暗示Nrf2可能是保護(hù)生殖細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　3.陰囊熱應(yīng)激小鼠對(duì)睪丸組織損傷及Nrf2保護(hù)作用的研究
　　為了闡明熱應(yīng)激對(duì)小鼠睪丸Nrf2-ARE抗氧化系統(tǒng)的影響。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)利用8周齡ICR小鼠施以一次陰囊42℃下25min水浴熱處理，并在熱處理后的3h、1、2、7和14天后，采集小鼠睪

9、丸組織樣品進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)，免疫組織化學(xué)以及實(shí)時(shí)定量PCR等分析。熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠睪丸生精上皮嚴(yán)重?fù)p傷，主要表現(xiàn)為產(chǎn)生多核巨細(xì)胞和生精細(xì)胞脫落。氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛含量在熱處理后3h和第1天顯著增加;睪丸組織谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶超氧化物歧化酶以及銅鋅超氧化物岐化酶在熱處理后都出現(xiàn)顯著性降低;小鼠熱應(yīng)激后第1天和第2天，睪丸組織中Cleaved caspase 3蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著增加;小鼠陰囊熱應(yīng)激還誘導(dǎo)了Nrf2蛋白表達(dá)，尤其

10、間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)明顯;小鼠熱應(yīng)激后第1天，睪丸組織Nrf2及其相關(guān)調(diào)控基因GCLC和NQO1相對(duì)表達(dá)量顯著升高。以上結(jié)果表明，小鼠陰囊熱應(yīng)激誘導(dǎo)睪丸組織氧化應(yīng)激，損傷睪丸生精上皮，并伴隨Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路的激活。
　　4.tBHQ不同處理方法對(duì)陰囊熱應(yīng)激小鼠睪丸損傷的保護(hù)作用
　　為了研究tBHQ對(duì)陰囊熱應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠睪丸組織損傷的影響，本試驗(yàn)利用8周齡雄性ICR小鼠，分別通過(guò)預(yù)飼喂1周添加tBHQ(1％w/w)的

11、日糧，腹腔預(yù)注射tBHQ（100mg/kgBW），或者睪丸預(yù)注射tBHQ（12.5mg/kgBW）的方法，建立小鼠tBHQ給藥模型。小鼠tBHQ預(yù)處理后，施以陰囊熱處理(42℃，25min)。陰囊熱應(yīng)激48h后，采集血清和睪丸組織樣品分析。與對(duì)照組相比，日糧飼喂和腹腔注射tBHQ組小鼠睪丸組織具有相對(duì)緊湊的間質(zhì)組織和相對(duì)完好的生精上皮結(jié)構(gòu)。睪丸注射tBHQ導(dǎo)致睪丸組織疏松和大量生精小管塌陷。另外，三種方法的tBHQ預(yù)處理都導(dǎo)致了睪酮濃度

12、降低和細(xì)胞色素P45017α-羥化酶/17，20-裂解酶(CYP17)的表達(dá)下降。這一結(jié)果表明，tBHQ可能通過(guò)抑制類(lèi)固醇合成導(dǎo)致睪酮分泌減少。通過(guò)日糧飼喂或腹腔注射tBHQ能一定程度上緩解陰囊熱應(yīng)激造成的睪丸組織損傷，并且適量的tBHQ可成為緩解雄性動(dòng)物睪丸組織熱應(yīng)激的有效抗氧化劑。
　　5.tBHQ激活Nrf2信號(hào)通路對(duì)陰囊熱應(yīng)激小鼠睪丸損傷保護(hù)作用的研究
　　本文旨在揭示預(yù)飼tBHQ對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響以及

13、tBHQ緩解陰囊熱應(yīng)激小鼠睪丸組織可能的機(jī)制。陰囊熱應(yīng)激前，8周齡ICR小鼠預(yù)飼喂1周添加tBHQ(1％w/w)的日糧。飼養(yǎng)結(jié)束后，給試驗(yàn)小鼠施以單次陰囊熱處理(42℃，25min)，然后在熱處理后的3h、1天、2天和7天，采集血清和睪丸樣品。預(yù)飼tBHQ可以維持陰囊熱應(yīng)激小鼠睪丸組織的完整性，表現(xiàn)為相對(duì)緊密的間質(zhì)和相對(duì)完整的生精上皮。預(yù)飼tBHQ使小鼠睪丸丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶(CA

14、T)活力顯著升高。陰囊熱應(yīng)激處理后，預(yù)飼tBHQ組小鼠睪丸組織MDA含量顯著低于未預(yù)飼tBHQ組小鼠，并且GSH含量以及CAT酶活力顯著高于未預(yù)飼tBHQ組小鼠。另外，與未預(yù)飼tBHQ組小鼠相比，預(yù)飼tBHQ使小鼠睪丸組織間質(zhì)Nrf2明顯表達(dá)，并且Nrf2及其調(diào)控基因HO-1和NQO1中mRNA表達(dá)顯著增高。上述結(jié)果表明，tBHQ預(yù)處理可能通過(guò)誘導(dǎo)小鼠睪丸組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酶類(lèi)和非酶類(lèi)抗氧化物質(zhì)上調(diào)，并激活Nrf2-ARE抗氧