急性砷暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟Nrf2信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：
　　 砷是地殼中普遍存在的較豐量的元素之一，廣泛存在于自然界，并越來越多的被應(yīng)用于人類生產(chǎn)生活中。砷及其化合物是國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確認(rèn)的人類致癌物。砷是一種全身性毒物，可以損傷機(jī)體許多組織、器官或系統(tǒng)。高砷暴露能夠產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，降低人體的抗氧化能力、并增加脂質(zhì)和DNA的氧化損傷。為避免ROS的損害或組織纖維化，機(jī)體具有一系列復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，其中

2、核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(transcription factorNF-E2-related factor2，Nrf2)信號(hào)通路是抗氧化應(yīng)答機(jī)制中最重要的一條信號(hào)通路。正常情況下，Nrf2定位于細(xì)胞質(zhì)中，并在細(xì)胞質(zhì)中與kelch樣ECH相關(guān)蛋白（kelch-like ECH-associated protein，Keap1）相互作用，經(jīng)由泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當(dāng)暴露于氧化應(yīng)激或親電試劑時(shí)，Nrf2與Keap1解離，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與Maf蛋

3、白形成異二聚體，然后該異二聚體再與ARE結(jié)合，調(diào)控Ⅱ相酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄活性，包括血紅素單加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinine oxidoreductase1，NQO1)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)、谷氨酰半胱氨酸合成酶(L-glutamate-cysteineligase，GCL)、谷胱甘肽過氧化物酶（Glut

4、athione peroxidase，GSH-Px）和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)等。這些酶能夠保護(hù)機(jī)體免受活性物質(zhì)(如ROS)及一些毒性物質(zhì)（如致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物）等的侵害。
　　 砷在人體內(nèi)的代謝過程主要在肝臟進(jìn)行。研究已經(jīng)明確，肝臟還是砷毒性和致癌性的主要靶器官。砷進(jìn)入機(jī)體后迅速吸收入血并隨血液分布到全身各個(gè)器官，腎臟則是其排泄、蓄積和毒性作用的重要器官。無(wú)機(jī)砷及其代謝物的排泄是

5、一個(gè)復(fù)雜的過程，包括腎小球過濾、分泌和近端小管的重吸收等。目前砷暴露與機(jī)體Nrf2信號(hào)通路的研究多在細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)行。關(guān)于砷與Nrf2關(guān)系的整體動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，目前為數(shù)不多。而目前對(duì)于整體動(dòng)物模型、尤其是人類急性砷暴露對(duì)肝臟和腎臟影響的研究多集中在病理和生化水平，對(duì)Nrf2信號(hào)通路在無(wú)機(jī)砷所致肝臟和腎臟損傷/疾病中的作用還有待研究。
　　 綜上所述，盡管大量細(xì)胞學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)無(wú)機(jī)砷是多種組織細(xì)胞類型中Nrf2通路的強(qiáng)烈誘導(dǎo)劑，并且認(rèn)為

6、該現(xiàn)象可能是毒物砷暴露刺激機(jī)體產(chǎn)生的一種防御應(yīng)答反應(yīng)。但是目前整體動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)尚不充分。在動(dòng)物肝臟和腎臟中，急性砷暴露能否誘導(dǎo)機(jī)體的Nrf2信號(hào)通路、其誘導(dǎo)表達(dá)是否具有劑量和時(shí)間效應(yīng)、Nrf2調(diào)控的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和/或活性等變化趨勢(shì)如何，等等，尚有待深入觀察。本研究擬采用小鼠整體動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察急性砷暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟Nrf2信號(hào)通路的影響，為深入理解Nrt2信號(hào)通路在砷暴露中的可能作用提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)

7、驗(yàn)方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 2、測(cè)定全血GSH含量:二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)法
　　 3、測(cè)定肝臟和腎臟GSH/GSSG含量:南京建成試劑盒
　　 4、測(cè)定肝臟和腎臟MDA含量:南京建成試劑盒
　　 5、測(cè)定肝臟和腎臟T-AOC能力:南京建成試劑盒
　　 6、肝臟和腎臟Nrf2及其下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平:western blot方法
　　 7、肝臟和腎臟Nrf2及其

8、下游調(diào)控基因的mRNA表達(dá)水平:RealTime PCR法
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、急性砷暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟Nrf2蛋白表達(dá)的影響
　　 與對(duì)照組相比，急性砷暴露各組小鼠肝臟和腎臟Nrf2蛋白表達(dá)水平均明顯增加。隨NaAsO2染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟和腎臟中Nrf2蛋白表達(dá)水平均先升高而后逐漸回落。
　　 2、急性砷暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟Nrf2 mRNA表達(dá)水平的影響
　　 與對(duì)照組相比，急性砷

9、暴露各組小鼠肝臟和腎臟Nrf2的mRNA表達(dá)水平均明顯增加。且隨NaAsO2染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，Nrf2的mRNA表達(dá)水平均呈先升高而后逐漸回落，且最高水平組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、急性砷暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控下游基因的蛋白表達(dá)的影響
　　 與對(duì)照組相比，急性砷暴露各組小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控的抗氧化酶(HO-1)、Ⅱ相解毒酶（NQO1和GSTO1）和GSH相關(guān)的抗氧化酶(

10、GCLc、GCLm和GR)的蛋白表達(dá)水平均明顯增加。隨NaAsO2染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟和腎臟中各蛋白表達(dá)水平均先升高而后逐漸回落。
　　 隨染毒劑量的升高，肝臟中Nrf2調(diào)控下游基因的蛋白表達(dá)水在10 mg/kgNaAsO2暴露組最高，而腎臟則在20 mg/kg NaAsO2暴露組最高。
　　 4、急性砷暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控下游基因的mRNA表達(dá)水平的影響
　　 與對(duì)照組相比，急性砷暴露各組小鼠肝臟和

11、腎臟Nrf2調(diào)控的抗氧化酶(HO-1)、Ⅱ相解毒酶(NQO1和GSTO1)和GSH相關(guān)的抗氧化酶(GCLc、GCLm和GR)的mRNA表達(dá)水平均明顯增加。隨NaAsO2染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控的下游基因的mRNA表達(dá)水平均先升高而后逐漸回落，且最高水平組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 隨染毒劑量的升高，肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控下游基因的mRNA水平均在10mg/kg NaAsO2暴露組

12、最高。
　　 在Nrf2調(diào)控下游基因中，HO1的mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它下游基因的mRNA表達(dá)水平。
　　 5、急性砷暴露24 h對(duì)小鼠全血和肝臟、腎臟中GSH含量及GSH/GSSG的比值的影響
　　 隨NaAsO2染毒劑量的升高，急性砷暴露24 h小鼠全血GSH含量整體上呈上升趨勢(shì);急性砷暴露24 h小鼠肝臟和腎臟中，隨染毒劑量的增加，GSH含量和GSH/GSSG均高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　

13、 6、急性砷暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷
　　 急性砷暴露24h小鼠肝臟和腎臟MDA含量隨染毒劑量的增加逐漸增加且均高于對(duì)照組(P＜0.05); T-AOC隨染毒劑量的增加逐漸降低且均低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 急性砷暴露能夠有效地持續(xù)性誘導(dǎo)小鼠肝臟和腎臟Nrf2的核轉(zhuǎn)位和活化、并進(jìn)一步激活Nrf2及其調(diào)控的抗氧化酶(HO-1)、Ⅱ相解毒酶(NQO1和GSTO1)和GSH相關(guān)的抗氧化酶(G