急性砷暴露對小鼠肝臟和腎臟Nrf2信號通路的影響.pdf

1、目的：
　　 砷是地殼中普遍存在的較豐量的元素之一，廣泛存在于自然界，并越來越多的被應用于人類生產(chǎn)生活中。砷及其化合物是國際癌癥研究機構(IARC)確認的人類致癌物。砷是一種全身性毒物，可以損傷機體許多組織、器官或系統(tǒng)。高砷暴露能夠產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，降低人體的抗氧化能力、并增加脂質(zhì)和DNA的氧化損傷。為避免ROS的損害或組織纖維化，機體具有一系列復雜的抗氧化防御系統(tǒng)，其中

2、核轉錄因子Nrf2(transcription factorNF-E2-related factor2，Nrf2)信號通路是抗氧化應答機制中最重要的一條信號通路。正常情況下，Nrf2定位于細胞質(zhì)中，并在細胞質(zhì)中與kelch樣ECH相關蛋白（kelch-like ECH-associated protein，Keap1）相互作用，經(jīng)由泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當暴露于氧化應激或親電試劑時，Nrf2與Keap1解離，轉移到細胞核，與Maf蛋

3、白形成異二聚體，然后該異二聚體再與ARE結合，調(diào)控Ⅱ相酶和抗氧化酶基因的轉錄活性，包括血紅素單加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinine oxidoreductase1，NQO1)、谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)、谷氨酰半胱氨酸合成酶(L-glutamate-cysteineligase，GCL)、谷胱甘肽過氧化物酶（Glut

4、athione peroxidase，GSH-Px）和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)等。這些酶能夠保護機體免受活性物質(zhì)(如ROS)及一些毒性物質(zhì)（如致癌物、藥物代謝活化產(chǎn)物）等的侵害。
　　 砷在人體內(nèi)的代謝過程主要在肝臟進行。研究已經(jīng)明確，肝臟還是砷毒性和致癌性的主要靶器官。砷進入機體后迅速吸收入血并隨血液分布到全身各個器官，腎臟則是其排泄、蓄積和毒性作用的重要器官。無機砷及其代謝物的排泄是

5、一個復雜的過程，包括腎小球過濾、分泌和近端小管的重吸收等。目前砷暴露與機體Nrf2信號通路的研究多在細胞學水平進行。關于砷與Nrf2關系的整體動物學實驗，目前為數(shù)不多。而目前對于整體動物模型、尤其是人類急性砷暴露對肝臟和腎臟影響的研究多集中在病理和生化水平，對Nrf2信號通路在無機砷所致肝臟和腎臟損傷/疾病中的作用還有待研究。
　　 綜上所述，盡管大量細胞學研究已經(jīng)證實無機砷是多種組織細胞類型中Nrf2通路的強烈誘導劑，并且認為

6、該現(xiàn)象可能是毒物砷暴露刺激機體產(chǎn)生的一種防御應答反應。但是目前整體動物學實驗的依據(jù)尚不充分。在動物肝臟和腎臟中，急性砷暴露能否誘導機體的Nrf2信號通路、其誘導表達是否具有劑量和時間效應、Nrf2調(diào)控的下游靶基因的轉錄、蛋白表達和/或活性等變化趨勢如何，等等，尚有待深入觀察。本研究擬采用小鼠整體動物學實驗，觀察急性砷暴露對小鼠肝臟和腎臟Nrf2信號通路的影響，為深入理解Nrt2信號通路在砷暴露中的可能作用提供理論依據(jù)。
　　 實

7、驗方法：
　　 1、實驗動物及分組
　　 2、測定全血GSH含量:二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)法
　　 3、測定肝臟和腎臟GSH/GSSG含量:南京建成試劑盒
　　 4、測定肝臟和腎臟MDA含量:南京建成試劑盒
　　 5、測定肝臟和腎臟T-AOC能力:南京建成試劑盒
　　 6、肝臟和腎臟Nrf2及其下游調(diào)控蛋白表達水平:western blot方法
　　 7、肝臟和腎臟Nrf2及其

8、下游調(diào)控基因的mRNA表達水平:RealTime PCR法
　　 實驗結果：
　　 1、急性砷暴露對小鼠肝臟和腎臟Nrf2蛋白表達的影響
　　 與對照組相比，急性砷暴露各組小鼠肝臟和腎臟Nrf2蛋白表達水平均明顯增加。隨NaAsO2染毒時間的延長，肝臟和腎臟中Nrf2蛋白表達水平均先升高而后逐漸回落。
　　 2、急性砷暴露對小鼠肝臟和腎臟Nrf2 mRNA表達水平的影響
　　 與對照組相比，急性砷

9、暴露各組小鼠肝臟和腎臟Nrf2的mRNA表達水平均明顯增加。且隨NaAsO2染毒時間的延長，Nrf2的mRNA表達水平均呈先升高而后逐漸回落，且最高水平組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、急性砷暴露對小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控下游基因的蛋白表達的影響
　　 與對照組相比，急性砷暴露各組小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控的抗氧化酶(HO-1)、Ⅱ相解毒酶（NQO1和GSTO1）和GSH相關的抗氧化酶(

10、GCLc、GCLm和GR)的蛋白表達水平均明顯增加。隨NaAsO2染毒時間的延長，肝臟和腎臟中各蛋白表達水平均先升高而后逐漸回落。
　　 隨染毒劑量的升高，肝臟中Nrf2調(diào)控下游基因的蛋白表達水在10 mg/kgNaAsO2暴露組最高，而腎臟則在20 mg/kg NaAsO2暴露組最高。
　　 4、急性砷暴露對小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控下游基因的mRNA表達水平的影響
　　 與對照組相比，急性砷暴露各組小鼠肝臟和

11、腎臟Nrf2調(diào)控的抗氧化酶(HO-1)、Ⅱ相解毒酶(NQO1和GSTO1)和GSH相關的抗氧化酶(GCLc、GCLm和GR)的mRNA表達水平均明顯增加。隨NaAsO2染毒時間的延長，小鼠肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控的下游基因的mRNA表達水平均先升高而后逐漸回落，且最高水平組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 隨染毒劑量的升高，肝臟和腎臟Nrf2調(diào)控下游基因的mRNA水平均在10mg/kg NaAsO2暴露組

12、最高。
　　 在Nrf2調(diào)控下游基因中，HO1的mRNA表達水平遠遠高于其它下游基因的mRNA表達水平。
　　 5、急性砷暴露24 h對小鼠全血和肝臟、腎臟中GSH含量及GSH/GSSG的比值的影響
　　 隨NaAsO2染毒劑量的升高，急性砷暴露24 h小鼠全血GSH含量整體上呈上升趨勢;急性砷暴露24 h小鼠肝臟和腎臟中，隨染毒劑量的增加，GSH含量和GSH/GSSG均高于對照組(P＜0.05)。
　　

13、 6、急性砷暴露對小鼠肝臟和腎臟的氧化損傷
　　 急性砷暴露24h小鼠肝臟和腎臟MDA含量隨染毒劑量的增加逐漸增加且均高于對照組(P＜0.05); T-AOC隨染毒劑量的增加逐漸降低且均低于對照組(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 急性砷暴露能夠有效地持續(xù)性誘導小鼠肝臟和腎臟Nrf2的核轉位和活化、并進一步激活Nrf2及其調(diào)控的抗氧化酶(HO-1)、Ⅱ相解毒酶(NQO1和GSTO1)和GSH相關的抗氧化酶(G