阻滯Nrf2基因?qū)ι橹缕つw角化相關(guān)基因及蛋白的影響研究.pdf

1、目的:研究Nrf2基因抑制及無(wú)機(jī)砷染毒對(duì)Nrf2通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響，探討其在砷致皮膚細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用，為砷致皮膚損傷提供理論依據(jù)。
　　方法:1.慢病毒載體的構(gòu)建：依據(jù) Nrf2基因序列構(gòu)建Nrf2 shRNA,重組慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。2.慢病毒包裝：Keap1抑制質(zhì)粒大量抽提擴(kuò)增，共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，收集病毒上清，測(cè)定病毒滴度。3.用不同的慢病毒載體（Nrf2 shRNA1/2/3和空載體）分別感染HaC

2、aT細(xì)胞構(gòu)建Nrf2基因抑制HaCaT細(xì)胞系，感染復(fù)數(shù)為5，48小時(shí)后，用1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。4.穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定：培養(yǎng)經(jīng)篩選獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2 mRNA表達(dá)水平。5.采用MTT還原法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，確定LC50及染毒濃度，染毒濃度分別為L(zhǎng)C50的1/100、1/50、1/10。6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。7.RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、Keap1、NF-κB、CBP、As3MT、K-

3、1、K-10、INV、LOR mRNA表達(dá)水平。8.ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中HO-1、SAM、HCY、As3MT蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.慢病毒干擾載體構(gòu)建，經(jīng)基因測(cè)序，與目的基因序列完全匹配，慢病毒滴度為2×108TU/ml。2.建立的Nrf2基因抑制穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中sh3最好，其基因的沉默效率為87％,作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。3.混合砷染毒模型細(xì)胞48h的LC50為210.00μmol/L，染毒濃度分別為L(zhǎng)C50的1/100（2.

4、10μmol/）L，LC50的1/50（4.20μmol/L），LC50的1/10（21.00μmol/L）。4.Keap1基因抑制、2.10μmol/L混合砷染毒促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快；隨染毒濃度增加（4.20μmol/L-21.00μmol/L）染毒時(shí)間延長(zhǎng)（48h、72h)細(xì)胞多核細(xì)胞出現(xiàn)，脫壁明顯。5.與Nrf2抑制對(duì)照組相比，8h和24h時(shí)2.1μmol/L、4.20μmol/L、21μmol/L濃度組早期凋亡率均升高

5、，且隨染毒濃度的增加，凋亡率增加；48h后其早凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。72h各濃度組早期凋亡率均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。6.與Nrf2抑制對(duì)照組及8h相比，Keap1抑制對(duì)照組24h、48h、72hKeap1 mRNA表達(dá)均下調(diào)（P<0.01），且隨時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；2.1μmol/L、4.2μmol/L、21μmol/L濃度組Keap1 mRNA表達(dá)24h、48h均下調(diào)（P<0.0

6、1），表達(dá)隨濃度增大呈上升趨勢(shì)。與Nrf2抑制對(duì)照組相比，空白對(duì)照組和Keap1抑制對(duì)照組72hNrf2 mRNA表達(dá)均上調(diào)（P<0.01）；2.1μmol/L濃度組24h、48h和72hNrf2 mRNA表達(dá)均上調(diào)（P<0.01）；而4.2μmol/L和21μmol/L24h、72hNrf2 mRNA表達(dá)均下調(diào)（P<0.01）。與空白對(duì)照組和Nrf2抑制對(duì)照組相比，較低濃度組（2.1、4.20μmol/L）細(xì)胞中NF-κB、CBP m

7、RNA的表達(dá)上調(diào)；高濃度組（21.00μmol/L）長(zhǎng)時(shí)間（48h、72h）NF-κB、CBP mRNA的表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各濃度組K-l mRNA在24h、48h時(shí)表達(dá)較空白對(duì)照組和Nrf2抑制對(duì)照組下調(diào)，72h明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白對(duì)照組和Nrf2抑制對(duì)照組相比，較低濃度組（2.10、4.20μmol/L）長(zhǎng)時(shí)間（48h、72h）K-l0 mRNA的表達(dá)上調(diào)，高濃度組K-l0

8、mRNA總體呈下調(diào)狀態(tài)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與空白對(duì)照組和Nrf2抑制對(duì)照組相比，較低濃度組（2.10、4.20μmol/L）INV、LOR mRNA24h和72h表達(dá)明顯升高，48h表達(dá)下調(diào)，21μmol/L濃度組INV、LOR mRNA24h后均呈下調(diào)狀態(tài)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。7.與空白對(duì)照組和Nrf2抑制對(duì)照組相比，4.2μmol/L和21μmol/L混合砷染毒促進(jìn)As3MT mRNA表達(dá)，2.10

9、、4.20μmol/L濃度組8h、24h、48hAs3MT蛋白含量下調(diào)，72h表達(dá)上調(diào)，21μmol/L濃度組長(zhǎng)時(shí)間48h、72h As3MT蛋白含量上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。8.與空白對(duì)照組相比，Keap1抑制對(duì)照組8h、48h和72hSAM蛋白含量均下調(diào)（P<0.01）；Nrf2抑制對(duì)照組24h、48h和72hSAM蛋白含量均上調(diào)（P<0.01）；與Nrf2抑制對(duì)照組相比，2.1μmol/L、4.2μmol/L、21

10、μmol/L濃度組隨時(shí)間延長(zhǎng)（24h、48h、72h）SAM蛋白含量均下調(diào)（P<0.01），同時(shí)間不同濃度組隨濃度升高，呈下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與空白對(duì)照組和Nrf2抑制對(duì)照組相比，8h、24h、48h和72hHCY蛋白含量均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白對(duì)照組和Keap1抑制對(duì)照組24h后HCY蛋白含量均低于Nrf2抑制對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與空白對(duì)照組和Nrf2抑制對(duì)照組相

11、比，2.10、4.20μmol/L濃度組HO-1蛋白含量由8h、24h的表達(dá)上調(diào)轉(zhuǎn)至48h、72h表達(dá)逐漸下調(diào)，21μmol/L濃度組HO-1蛋白含量基本維持下調(diào)水平；且均隨濃度增加表達(dá)逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:1.混合砷染毒能引起細(xì)胞形態(tài)改變，低濃度促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2.Nrf2基因抑制聯(lián)合混合砷染毒細(xì)胞， Nrf2通路相關(guān)基因（Nrf2、Keap1、NF-κB、CBP、As3MT