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文檔簡介
1、目的:
觀察nrf2基因啟動子-336位點多態(tài)性對酒精性肝病小鼠感染創(chuàng)傷弧菌(VV)的影響及早期促/抗炎細胞因子(TNF-α、IL-10)、高遷移蛋白(HMGB1)的水平變化。
方法:
1.C57B6小鼠,300只,隨機取20只正常飼養(yǎng),余下280只采用酒精梯度飼養(yǎng)法替代水飼養(yǎng),56天后隨機取10只小鼠肝組織做病理,提示脂肪變性,完成酒精性肝病小鼠模型。正常小鼠中隨機取10只為正常對照組(A1組
2、=10只),余10只腹腔注射VV(濃度為1×106cfu/ml,量為5ml/kg),制作創(chuàng)傷弧菌膿毒癥模型(C組),染菌后48h死亡2只(C組=8只);270只酒精肝病小鼠隨機取10只為酒精肝病模型組(B1組=10只),余下260只腹腔注射VV(腹腔注射濃度為1×106cfu/ml,量為5ml/kg),制作酒精肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥模型組(D組),染菌后48h,D組死亡59只(D組=201只),留取存活D組小鼠肝組織適量,提取DNA,采用基
3、因測序法檢測nrf2基因啟動子-336位點的基因序列,分為非突變組
(-336T)(D1組=7只)及突變組(-336C)(D2組=194只)。
2.觀察各組小鼠在感染創(chuàng)傷弧菌后的體溫、呼吸、精神狀態(tài)等情況的改變,光鏡下觀察各組小鼠肝組織病理變化,隨機取酒精肝病感染VV組(D組)和正常感染VV組(C組)小鼠各10只,無菌取血后予常規(guī)血培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌。
3.采用基因測序法檢測D組小鼠nrf2基因啟動子
4、-336位點上非突變組(D1組)與突變組(D2組);通過WesternBlot法檢測nrf2蛋白的表達;RT-PCR方法分別檢測各組小鼠肝組織nrf2,HMGB1,TNF-α,IL-10基因的表達;ELISA法檢測HMGB1,TNF-α,IL-10組織中蛋白的表達。
4.實驗數(shù)據(jù)以中位數(shù)(Median)和四分位間距(QR)來表示,應用SPSS10.0進行統(tǒng)計分析,兩個和多個樣本比較采用非參數(shù)的秩和檢驗(兩樣本Mann-Wh
5、itney、多樣本Kruskal-Wal1isH法)進行分析,P<0.05及P<0.05/3為差異具有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果:
1.酒精肝病小鼠在感染VV后3h出現(xiàn)活動減少,進食飲水減少,6h后皮溫升高,肢端及口唇發(fā)紺明顯,精神萎靡,反應明顯變慢,呼吸急促,豎毛現(xiàn)象,隨著時間的推延,四肢遠端呈暗紫色,不能承力,行走時前述癥狀加重,染菌后48h血培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌為陽性。
2.基因測序法對201只酒精肝病感
6、染VV小鼠進行nrf2基因啟動子下游-336位點進行基因序列檢測,其中有7只小鼠在該位點的基因序列為A,即上游序列為T(D1組),194只小鼠在該位點的基因序列為G,即上游序列為C(D2組)。
3.感染創(chuàng)傷弧菌48小時后,D1組酒精肝小鼠肝組織nrf2mRNA的表達是0.746(0.288),D2組酒精肝小鼠肝組織nrf2mRNA的表達是0.352(0.156).與D1組比較,明顯降低(P<0.05/3);A1組小鼠肝組織
7、nrf2mRNA的表達是0.115(0.018),D1組、D2組與A1組分別比較,均明顯增高(P<0.05/3);B1組酒精肝小鼠肝組織nrf2mRNA的表達是0.173(0.053),D1組、D2組與B1組分別比較,均明顯增高(P<0.05/3)。
4.感染創(chuàng)傷弧菌48小時后,D1組酒精肝小鼠肝組織nrf2蛋白的表達是3.982(2.407),D2組酒精肝小鼠肝組織nrf2蛋白的表達是2.243(1.311),與D1組比
8、較,明顯降低(P<0.05/3);A1組小鼠肝組織nrf2蛋白的表達是0.908(0.580),D1組、D2組與A1組比較,明顯增高(P<0.05/3);B1組酒精肝小鼠肝組織nrf2蛋白的表達是1.461(0.501),D1組、D2組與B1組比較,明顯增高(P<0.05/3)。
5.感染創(chuàng)傷弧菌48小時后,D1組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達是0.508(0.294)、0.399(0.1
9、37)、1.825(0.656),D2組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達是1.021(0.551)、0.699(0.166)、1.403(0.518),與D1組比較,HMGB1、TNF-α明顯增高,IL-10明顯降低(P<0.05/3);A1組小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達是0.230(0.107)、0.140(0.057)、0.338(0.121),D1組、D2組與A1組分別
10、比較,均明顯增高(P<0.05/3);B1組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10mRNA的表達是0.410(0.152)、0.254(0.080)、0.637(0.157),D1組與B1組比較,HMGB1無明顯差別(P>0.05/3),TNF-α、IL-10明顯增高(P<0.05/3):D2組與B1組比較,HMGB1、TNF-α、IL-10,明顯增高(P<0.05/3)。
6.感染創(chuàng)傷弧菌48小時后,D1組酒
11、精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達是6.24(1.64)、174.60(50.52)、57.98(19.55),D2組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達是12.89(3.74)、266.11(55.41),41.53(8.35)與D1組比較,HMGB1、TNF-α明顯增高,IL-10明顯降低(P<0.05/3);A1組小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達是2.01(1.
12、21)、114.07(24.42)、13.97(6.45),D1組、D2組與A1組比較,明顯增高(P<0.05/3);B1組酒精肝小鼠肝組織HMGB1、TNF-α、IL-10蛋白的表達是6.05(1.84)、142.94(33.89)、22.54(7.58),D1組與B1組比較,HMGB1無明顯差別(P>0.05/3),TNF-α、IL-10明顯增高(P<0.05/3);D2組與B1組比較,HMGB1、TNF-α、IL-10,明顯增高(
13、P<0.05/3)。
7.光鏡下A1組肝小葉完整,肝細胞條索清晰,匯管區(qū)無擴張;與A1組比較,B1組可見大量脂肪滴,空泡樣和氣球樣改變;C組可見炎癥細胞浸潤,肝匯管區(qū)擴張;D組肝小葉完整性破壞,匯管區(qū)可見擴張的肝管和靜脈,肝細胞條索紊亂。
結(jié)論:
nrf2基因啟動子上游-336位點T→C突變使酒精性肝病C57B6小鼠體內(nèi)nrf2表達明顯降低,并加劇酒精性肝病C57B6小鼠在感染創(chuàng)傷弧菌時的炎癥反
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